灵芝菌糠悬浊液培养粉状毕赤酵母研究
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摘 要：通过混合因子设计，以粉状毕赤酵母最大生物量为参照，比较了在以灵芝菌糠悬浊液为主要成分的液体培养基中，菌糠浓度、菌糠处理方式、玉米粉添加量三者对粉状毕赤酵母生长的影响，初步考察了经膨化处理的菌糠和未经处理的菌糠之间的区别，得到了经优化的灵芝菌糠悬浊液培养基，其最优配方为膨化灵芝菌糠0.100 g・mL-1，玉米粉0.010 g・mL-1，经由52 h培养后，粉状毕赤酵母的最大生物量为4.527×1010 CFU・mL-1。
关键词：菌糠；培养基；膨化；毕赤酵母
中图分类号：S646.9 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.07.031
Abstract：Though mixed factor design，and in condition of the maximum biomass at Pichia farinose， the effect on the Pichia farinose growth in liquid culture mediums which are mainly WMFC of three factors was compared including waste material from fungal culture （WMFC）；the processing method of WMFC；the addition of maize flour，and the difference of WMFC between puffing treatment and untreated was preliminary studied，and the optimized composition of WMFC liquid culture mediums was obtained. The optimal formula of this culture medium composition was including puffed WMFC of ganoderma lucidum 0.100 g・mL-1，maize flour 0.010 g・mL-1.By cultured in this culture mediums，the maximum biomass of Pichia farinose could reach in 4.527×1010 CFU・mL-1after 52 hours.
Key words：waste material from fungal culture （WMFC）；culture；puffing；Pichia farinose
在食用菌栽培生产过程中，产生了大量含有菌丝体的培养基质，在栽培结束后，这种被称为菌糠（Waste medium of fungi culture，WMFC）的培养基废料的处理问题一直是食用菌栽培中的重要问题，尤其在近年来我国食用菌栽培的规模已经十分可观的情况下，产生的废弃菌糠以万t计[1]。食用菌菌糠中含有大量来自于所栽培食用菌菌丝体的多糖和菌体蛋白，以及尚未利用的培养基成分，营养价值上超越了作物秸秆，甚至于和麸类[2-3]以及玉米粉[4]相当。因此，将食用菌菌糠作为微生物发酵培养基的主要成分，拓展工业微生物培养基的原料来源，在实际生产上具有重要的意义。
由于菌糠来源于食用菌栽培培养基，大部分营养成分已经被食用菌所利用，或转化成菌丝成分，或转化为具有化感作用的代谢产物，使得菌糠对于同种或异种食用菌菌丝体有明显的抑制作用[5-6]。其中，大部分为食用菌的细胞壁成分，为结构复杂的杂多糖类物质[7]。因此，通过挤压膨化处理这种物理手段，对其菌糠进行预加工，以期改变原有的糖类、纤维类物质的组成，并去除化感物质，不失为一种廉价而有效的处理废弃菌糠的方法。
因此，本研究以灵芝菌糠以及膨化处理后的灵芝菌糠作为发酵培养基原料，进行培养毕赤酵母的初步研究，为食用菌菌糠的新的利用方式提供理论依据，并验证膨化处理方式在食用菌菌糠处理方面的可行性。
1 材料和方法
1.1 菌 种
粉状毕赤酵母Pichia farinosa，编号FL7，引自天津大学化工学院，分离自天津市林业果树研究所实验基地所采集的食用菌菌糠废弃物堆肥，使用0.5 mL YEPD液体培养基[8-9]分装于1 mL聚丙烯离心管中于4 °C冰箱保藏。
1.2 原料及处理
菌糠悬浊液培养基的制备采用以下2种经过不同处理的灵芝菌糠。
普通灵芝菌糠：取赤芝Ganoderma lucidum栽培结束，子实体已采收后所余含有菌丝体及剩余培养基之菌糠，经粉碎机粉碎后，过孔径为0.25 mm的筛，80 °C烘干至恒质量备用。
膨化灵芝菌糠：将普通灵芝菌糠经双螺杆挤压机膨化处理后[10]，冷却并粉碎，过孔径为0.25 mm的筛，80 °C烘干至恒质量备用。
玉米粉：取超市所售玉米粉过孔径为0.25 mm的筛，80 °C烘干至恒质量备用。
1.3 培养基
（1）种子培养基。采用YEPD液体培养基作为酵母种子培养基，具体配方如下：蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蒸馏水1 000 mL，pH值 6.0。将上述成分分别溶解于蒸馏水中，调整pH值并定容后，分装20 mL加于50 mL广口三角瓶中，棉塞封口后于121 °C高压蒸汽灭菌30 min，待冷却后备用。
（2）测试培养基。灵芝菌糠悬液培养基测试选取灵芝菌糠浓度、菌糠处理工艺、辅料玉米粉添加量3因子，设计全因子试验，因子和水平及培养基各处理配比见表1，所有处理以及CK对照组皆设3个重复。
取50 mL广口三角瓶，除对照组CK外，按表1中各处理对应的因子和水平加入灵芝菌糠、玉米粉和蒸馏水后，玻棒搅动至玉米粉和菌糠均匀分散，不经调节pH值，棉塞封口后于121 °C高压蒸汽灭菌30 min，待冷却后取出，超净台内晾干表面残水后备用。各处理皆设3个重复。
（3）对照及计数培养基。与种子培养基相同的YEPD培养基作为测试培养基的对照组CK，测试培养基，亦设3个重复，配方及制备方式同1.1。计数培养基为YEPD固体琼脂平板。如上述YEPD液体培养基中加入琼脂20 g・L-1，于121 °C高压蒸汽灭菌30 min后倾注90 mm平板备用。
1.4 培养方法
种子的制备：取制备好的YEPD液体培养基，以100 μL移液枪接入保藏酵母菌种10 μL，置于恒温摇床中，160 r・min-1，25 °C培养48 h后立即使用。
测试培养基的接种：以YEPD培养基中摇瓶培养48 h的毕赤酵母菌液作为种子，于超净台上振荡混匀后以移液枪吸取菌液接入各处理中，每瓶接种10 μL。摇匀后，置于恒温摇床中，160 r・min-1，25 °C避光培养。
经由预备试验，通过血球计数板进行活菌计数[11]，确定培养基中的酵母最大生物量大致出现在培养52 h之后。因此，在酵母培养至第48 h后，每隔约4 h取样，取样时将三角瓶移入超净台中，用振荡器充分摇匀发酵液，移液枪吸取10 μL发酵液注入预先灭菌并干燥后的1 mL聚丙烯离心管中。各处理及其重复同一时间点取样各1次，并记录准确取样时间。取样后重新加棉塞，移入恒温摇床继续培养，重复上述过程直至各培养基发酵至72 h。
1.5 计数方法
采用梯度稀释―微量点样法[12]进行酵母活菌计数。具体操作如下：将含有取样样品的聚丙烯离心管中加入90 μL无菌蒸馏水，振荡器充分混匀后即为发酵液10-1梯度。从此离心管中再取10 μL再加入新离心管中，以移液枪加入90 μL无菌蒸馏水，以振荡器充分混匀后即为发酵液10-2梯度，以此类推至10-15为止。
使用移液枪将上述各梯度稀释液分别吸取10 μL，按稀释度的大小顺序点样于1.3所述YEPD琼脂平板上，不加涂布，任其自然形成稀释液的圆型斑点。各稀释度点样3次重复。点样后静置平皿待稀释液已被平皿琼脂表面吸收后，加盖并标记各点样处所对应的稀释倍数和测试培养基编号，放置于25 °C恒温箱避光静置培养48 h。
菌落形成后，对各稀释梯度斑点中的酵母菌落进行手工计数和统计。为避免系统误差，仅选取菌落数量大于3个小于40个的稀释梯度进行发酵液中酵母活细胞数的计算。若有1个以上的稀释液斑点满足上述规则，则对比二者之间的比值，若比值小于等于2即取平均数，若比值大于2则只记录稀释倍数较大、菌落总数较小的斑点；若所有稀释液斑点中的菌落数均大于40则以最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数计算；若菌落数均小于3则以最低稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数计算；若都不存在菌落则以1乘以最小稀释倍数计算。
以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）来表示活酵母生物量，以CFU・mL-1用以表示各处理发酵液中的活酵母生物量，计算公式：
CFU= ×10n
式中，CFU为每毫升发酵液中的活酵母菌落形成单位，CFU・mL-1；v为点样样品体积，mL；N为样品斑点中的酵母菌落数；n为N所对应的样品稀释次数。
以上所得各处理3个重复中各个发酵液中平均活酵母数，按日期汇总后，原始数据录入EXCEL软件，为计算方便，将全部数据换算成以e为底数的自然对数值ln CFU・mL-1，输入SPSS19.0软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 毕赤酵母的最大生物量
测试培养基各处理中，毕赤酵母的最大生物量平均值（同处理的3个重复）如表2。
2.2 方差分析
将表2所述各处理及其3个重复所得最大生物量数据，录入统计软件SPSS19.0软件进行方差分析。选取因子A为3水平组内因子，因子C为2水平组内因子，因子B为2水平组间因子，使用一般线性模型的重复度量模式进行方差分析，得到方差分析表如表3。
由表3组间因子与组内因子方差分析可见，主效应中，因子A灵芝菌糠浓度，因子B菌糠处理方式，因子C玉米粉添加量三者均达到极显著（P
2.3 交互作用和简单效应分析
在SPSS19.0软件中的syntax模式即语法模式下，使用EMMEANS命令，手动编程对各因子进行简单效应分析，并对各因子及水平进行两两比较。所用代码见参考文献[11]，此处不再赘述。将代码以及数据录入SPSS后，所得结果整理如表4的各因子简单效应分析表。
2.3.1 灵芝菌糠浓度与菌糠处理方式的简单效应分析 由表4中因子A对因子B的简单效应分析和两两比较可以看出，因子A在A1水平下对因子B的2个水平简单效应显著，且B2>B1，即在0.010 g・mL-1菌糠浓度下，膨化菌糠要优于未处理菌糠；在A2水平下对因子B简单效应不显著，即在0.050 g・mL-1菌糠浓度下，膨化菌糠和未处理菌糠并无区别，A3水平下，因子A对因子B的2水平又出现了简单效应显著，同样B2>B1，即在0.100 g・mL-1菌糠浓度下，膨化菌糠要优于未处理菌糠。同时，在因子B对因子A的简单效应分析和两两比较可以看出，因子B在B1水平下对因子A的3个水平简单效应显著，且A3>A2>A1，即未处理菌糠的不同浓度对酵母的生物量有明显的影响，且随菌糠浓度的增大而增大；在B2水平下仅与A3水平简单效应显著，A3>A2，A1，即膨化菌糠在0.010 g・mL-1的浓度下和0.050 g・mL-1的浓度下酵母生物量并没有区别，在浓度至0.100 g・mL-1时，酵母的生物量较低浓度有明显增加。
综上，菌糠浓度对酵母生物量的影响与菌糠的不同处理方式密切相关，经过膨化处理的菌糠在0.100 g・mL-1浓度下培养的解磷酵母生物量最大。至于在0.050 g・mL-1浓度下为何处理方式不同的菌糠，以及不同处理方式的菌糠在0.010 g・mL-1与0.050 g・mL-1下不存在显著性差异，一个可能的解释是与不同处理的菌糠中所含有的速效/迟效碳源、氮源的比例以及二者不同的碳氮比有关，但这尚需进一步的试验。
2.3.2 灵芝菌糠浓度与玉米粉添加量的简单效应分析 由表4中因子A对因子C的简单效应分析和两两比较可以看出，因子A在A1水平下对因子C的2个水平简单效应不显著，即在0.010 g・mL-1菌糠浓度下，添加玉米粉与否并无明显区别；在A2水平下对因子C的2水平简单效应显著，且C2>C1，即在0.050 g・mL-1菌糠浓度下，添加0.010 g・mL-1玉米粉对酵母生物量有明显的促进；在A3水平下，对因子C的2水平简单效应显著，但相反的C1>C2，即在0.100 g・mL-1菌糠浓度下，添加0.010 g・mL-1玉米粉反而对酵母生长产生了抑制，生物量反而减少。同时，在因子C对因子A的简单效应分析和两两比较可以看出，因子C在C1水平下对因子A的3个水平简单效应显著，且A3>A2，A1，即未添加玉米粉的灵芝菌糠，仅在0.100 g・mL-1浓度对酵母的生物量有明显的影响，这与因子B对因子A的简单效应的结论相同；在C2水平下因子A的3水平简单效应显著，A3>A2，A1，即在添加0.010 g・mL-1玉米粉的情况下，不同浓度的灵芝菌糠对酵母的生物量仍然随菌糠浓度的增大而增大。
综上，玉米粉添加量对酵母生物量的影响受菌糠浓度的制约，只有在0.050 g・mL-1的菌糠浓度下才有促进生长的作用，这显然和玉米粉加入后改变了培养基的碳氮比有关。在添加玉米粉的情况下，酵母的生物量随灵芝菌糠的浓度增大而增大。
2.3.3 菌糠处理方式与玉米粉添加量的简单效应分析 因子B在B1水平下对因子C的2个水平简单效应不显著，即对未处理菌糠而言，添加玉米粉对酵母生长并无促进；在B2水平下对因子C的2个水平简单效应显著，C2>C1，即在膨化菌糠中添加0.010 g・mL-1玉米粉要显著优于不添加的，经过膨化处理的菌糠和玉米粉配合良好，也从一个侧面说明培养基中的碳氮比和速效迟效碳源氮源的比例，膨化和非膨化的菌糠是不同的。因子C对因子B的简单效应分析与上述相同。
3 结 论
在此试验体系下，灵芝菌糠悬浊液培养基的最优配方为膨化灵芝菌糠0.100 g・mL-1，玉米粉0.010 g・mL-1，蒸馏水，经由52 h培养后，粉状毕赤酵母的最大生物量为4.527×1010 CFU・mL-1，远高于YEPD培养基的8.987×109 CFU・mL-1。
两种不同处理的菌糠在0.100 g・mL-1浓度下培养的解磷酵母生物量最大，在0.050 g・mL-1浓度下对酵母生物量的影响近似。
玉米粉添加量对酵母生物量的影响受菌糠浓度的制约，只有在0.050 g・mL-1的菌糠浓度下才有促进生长的作用，在添加玉米粉的情况下，酵母的生物量随灵芝菌糠的浓度增大而增大。
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