糖络宁对糖尿病大鼠背根神经节线粒体DNA及电镜下线粒体结构的影响
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[摘要] 目的 观察糖络宁对糖尿病大鼠背根神经节线粒体dna、8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）及线粒体结构的影响。 方法 选取14只SD大鼠作为正常组，其余SD大鼠采用链脲佐菌素制作糖尿病大鼠模型，造模成功后，将其随机分为模型组、西药组（α-硫辛酸）、中药组（糖络宁），共给药8周，给药结束后，检测线粒体DNA水平、8-OHdG水平，并运用电镜观察线粒体内部结构。 结果 与正常组比较，模型组大鼠神经细胞线粒体DNA、8-OHdG水平明显增加（P < 0.01）；与模型组比较，中药组与西药组神经细胞线粒体DNA、8-OHdG水平明显降低（P < 0.01）。与正常组比较，模型组大鼠DRG线粒体肿胀明显，内部结构破坏严重，线粒体内特异结构嵴消失；而中药组大鼠DRG线粒体结构相对完整，线粒体嵴保存完好；西药组大鼠DRG线粒体也存在轻度肿胀，内部结构不完整，嵴显示不清楚。 结论 糖尿病大鼠神经细胞中线粒体会发生明显改变，其内部结构严重破坏，DNA表达过度升高，DNA的氧化损伤也非常明显。糖络宁可明显减低线粒体DNA表达，减少氧化损伤，缓解线粒体结构的破坏，这是糖络宁治疗糖尿病周围神经病变的机制之一。
[关键词] 糖络宁；糖尿病；大鼠；线粒体；DNA；电镜
[中图分类号] R587 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）04（b）-0004-05
[Abstract] Objective To investigate the effect of Tangluoning on activities of mitochondrial DNA， 8-OHdG and structure of electron microscope in dorsal root ganglion in diabetic rats. Methods Fourteen SD rats were selected as normal group， the other SD rats were given streptozotocin to make diabetic rats model， after success， they were randomly divided into model group， Western medicine group （α-lipoic acid）， TCM group （Tangluoning）. The activities of mitochondrial DNA， 8-OHdG were detected， and the mitochondrial structure was observed by electron microscope after 8 weeks′ treatment. Results Compared with normal group， the activities of mitochondrial DNA and 8-OHdG in model group were significantly increased （P < 0.01）. Compared with model group， the activities of mitochondrial DNA and 8-OHdG in Western medicine group and TCM group were significantly decreased （P < 0.01）. Compared with normal group， diabetic rats DRG mitochondria was swelled， the internal structure was damaged obviously and seriously， the specific structure of the mitochondria cristae was disappeared； and DRG mitochondria of TCM group had relatively intact structure， the mitochondrial cristae was well preserved； DRG mitochondria of Western medicine group also existed mild swelling， the internal structure was not complete， crest display was not clear. Conclusion In diabetic rats， the mitochondria of nerve cells is changed significantly， the internal structure is damaged seriously， the DNA expression is increased excessively， and the oxidative damage of DNA is also very obvious. Tangluoning can significantly decrease the expression of mitochondrial DNA， reduce the oxidative damage， and alleviate the destruction of mitochondrial structures， which is one of the mechanisms of Tangluoning in the treatment of diabetic peripheral neuropathy.
[Key words] Tangluoning； Diabetes； Rats； Mitochondria； DNA； Electron microscope
糖尿病性周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病最常见的慢性并发症之一，发病率高[1-2]，可累及多种神经组织，产生疼痛、麻木甚至运动障碍，严重影响糖尿病患者的生存质量[3-4]。目前DPN的发病机制仍不清楚，近年对其发病机制的研究主要集中在氧化应激（oxidative stress）上[5-6]，线粒体作为神经细胞中核心的产能细胞器，高度参与了氧化应激，是DPN发病的重要机制[7-8]。多年的临床研究证实，中药复方制剂糖络宁治疗DPN效果显著[9-11]，但作用机制、作用靶点不明，本研究复制糖尿病大鼠模型，观察糖络宁对糖尿病大鼠背根神经节细胞线粒体DNA及电镜下线粒体结构的影响，从而探讨其治疗DPN的机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级雄性8周SD大鼠，体重200～250 g，合格证号：SCXK（京）2012-0001，由北京维通利华试验动物技术有限公司供给。购入后置于北京中医药大学动物实验中心饲养。实验室条件：国标GB14925-2001规定动物实验设施大鼠清洁级屏障环境[环境安全合格证号：SYXK（京）2011-0024]，室内相对温度（25±1）℃，相对湿度（60±10）%。
1.2 试剂
链脲佐菌素（STZ，美国Merck公司，批号：B69776）；线粒体相关试剂盒（上海杰美基因医药科技公司）；8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）检验试剂盒（日本Japanese aged control institute）；α-硫辛酸（a-lipoic acid）（批号：82159-09-9）。
1.3 仪器
恒温加热块（鼎国昌盛生物技术有限公司）；离心机（eppendorf centrifuge 5417R 型）；LX-100手掌式离心机（其林贝尔仪器）；电热恒温水浴锅（长安科学仪器）；荧光偏震仪（全波长多功能酶表仪，intinite M1000，瑞士Tecan）；高速低温离心机（美国Beckman公司）；722分光光度计（上海分析仪器二厂）；恒温二氧化碳培养箱（美国Forma公司）；ELX800型自动酶标仪（美国BIO.TEK公司）；pH计（上海雷磁仪器厂）。
1.4 造模、分组及给药方式
造模、分组及给药方式均参照既往研究[12-13]。选用8周雄性SD大鼠80只，造模前随机选择14只作为正常组，其余大鼠予STZ 60 mg/kg腹腔注射，72 h后测血糖≥16.7 mmol/L为造模成功，将成模大鼠共61只随机分为西药组（19只）、中药组（21只）、模型组（21只）。中药组给予糖络宁制剂按生药5 g/（kg・d）灌胃；西药组按20 mg/（kg・d）灌胃，将α-硫辛酸用蒸馏水配成混悬液（2.5 mg/mL）灌胃；模型组给予等量蒸馏水灌胃。实验期间自由饮食，根据既往实验研究经验，连续给药8周可达到较好效果。实验结束，西药组、中药组、模型组分别死亡大鼠2、3、3只，各组最终剩余大鼠数量分别为17、18、18只。由于神经组织及线粒体取材困难，故本研究在实验结束时统一取材，未在实验中段取材观察各组疗效。
1.5 背根神经节取材及线粒体提取
背根神经节取材及线粒体提取均参照既往研究[12-13]，最终提取样本放进-70℃冰箱里备用。
1.6 线粒体DNA的测量[14-15]
采用相对定量方法测定，运用iCycler iQ实时检测系统进行实时PCR扩增和SYBR绿色荧光检测：将提取好的线粒体经过均匀加工处理后分别以800 r/min及7000 r/min，离心10 min，离心半径为75 mm，取沉淀物为线粒体断片，各加入1 mL 10 mmol/L EDTA、10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、150 mmol/L NaCl及0.2% SDS进行再加工处理，所得物在56°C下用蛋白激酶K孵化70 min，然后加热至95℃ 10 min，再加入等容量的苯酚、氯仿和异戊醇提取mtDNA。共10 ng基因组DNA用于线粒体DNA和核DNA标记，在25 μL反应液中包含1X SYBR Green iCycler iQ混合物和0.2 μM的正向和反向基因特异性引物，引物序列见表1。荧光阈值（Ct）值运用iCycler iQ系统软件进行计算：①计算ΔCt：ΔCt=Ct靶基因A（Action）-Ct细胞色素b，分别计算实验组和正常组的ΔCt。②计算ΔΔCt：ΔΔCt=ΔCt检测组-ΔCt正常组；③计算相对表达量的差值2-ΔΔCt。
1.7 线粒体8-OHdG的测量[16-17]
应用双抗体夹心法测定大鼠DRG线粒体8-OHdG水平，运用专门的8-OHdG酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒进行测试：将提取好的线粒体用原倍标准品在小试管中进行稀释；分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，在酶标包被板上标准品准确加样50 μL，待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL；用封板膜封板后置37℃温育30 min；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干；每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外；每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min；每孔加终止液50 μL，终止反应（此时蓝色立转黄色）；以空白空调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15 min以内进行；计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。得出标准曲线的回归方程为y=634.05x+9.5594（R2=0.9697）。
1.8 电镜观察线粒体结构
运用透视电子显微镜对标本进行观察：组织固定，在“低温”条件下（0～4℃）操作，使用两步固定法，第1次固定使用戊二醛固定液，经过充分洗涤后，用锇酸作第2次固定，2次固定的时间相同，均为20 min；组织脱水：按照标准流程进行脱水：50%乙醇10 min，70%乙醇10 min，85%乙醇10 min，95%乙醇15 min，100%乙醇15 min，100%乙醇15 min，中间溶剂10 min；组织包埋：组织脱水后入中间溶剂，直接入纯丙酮与包埋剂混合液中开始浸透，接着包埋于新换的包埋剂于预先干燥的胶囊中聚合，后2次包埋剂不更换胶囊；超薄切片：使用超薄切片机切片，切出来的切片收集到有Formva支持膜的载网上，从水中捞起晾干，放入电镜中观察。
1.9 统计学方法
采用SPSS 11.5软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠背根神经节线粒体DNA及8-OHdG水平比较
与正常组比较，模型组大鼠神经细胞线粒体DNA表达明显增多（P < 0.01）；与模型组比较，中药组与西药组神经细胞线粒体DNA表达明显减少（P < 0.01）。与正常组比较，模型组大鼠神经细胞线粒体中8-OHdG水平明显升高（P < 0.01）；与模型组比较，中药组与西药组神经细胞线粒体中8-OHdG水平明显降低（P < 0.01）。见表2。
2.2 各组大鼠背根神经节线粒体电镜观察结果
电镜观察DRG线粒体显示：与正常组比较，模型组大鼠DRG线粒体肿胀明显，内部结构破坏严重，线粒体内特异结构嵴消失；而中药组大鼠DRG线粒体结构相对完整，线粒体嵴保存完好；西药组大鼠DRG线粒体也存在轻度肿胀，内部结构不完整，嵴显示不清楚。见图1～4。
3 讨论
糖络宁是笔者根据多年临床经验总结出的中药复方制剂，药物组成主要包括生黄芪、山萸肉、狗脊、丹参、全蝎等，经过十余年的观察，疗效确切，但其具体作用机制尚不清楚[9-11]。根据笔者既往研究发现，糖络宁可降低大鼠坐骨神经山梨醇水平[18]，升高大鼠血清神经生长因子（NGF）含量和坐骨神经NGF mRNA表达[19]，增加血清中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的含量，上调糖尿病大鼠肝组织IGF-1 mRNA表达[20-21]。另外笔者针对神经细胞线粒体的研究还提示，糖络宁可显著改善糖尿病大鼠背根神经节线粒体抗氧化剂的活性[12]，提高糖尿病大鼠背根神经节中线粒体呼吸链各个复合物的活性[13]，减少和改善线粒体氧化应激。
本研究则从更深层次的DNA水平、DNA损伤来验证糖络宁的作用机制，实验结果提示，在高血糖状态下线粒体的DNA表达是更加活跃的，线粒体中8-OHdG水平显著升高。线粒体作为细胞氧化代谢最主要的细胞器，其DNA表达过度增加会直接导致氧代谢的提升，从而间接增加氧化应激的产生；8-OHdG作为反映DNA氧化损伤的重要指标，其水平升高表明高血糖下大鼠神经细胞线粒体DNA的氧化损伤十分明显，线粒体中的氧化应激明显增加；糖络宁和α-硫辛酸均可明显抑制神经细胞线粒体DNA的过度表达，降低神经细胞线粒体中8-OHdG水平，这表明糖络宁及硫辛酸均可减少高血糖导致的线粒体DNA的氧化损伤，对线粒体DNA起到很好的保护作用，这可能是糖络宁及硫辛酸治疗DPN的机制之一。
线粒体内部结构的完整对于其功能的保障非常重要，通过电镜观察DRG线粒体证实，糖尿病大鼠DRG线粒体肿胀明显，内部结构破坏严重，中药组大鼠DRG线粒体结构相对完整，线粒体嵴保存完好，初步认为中药糖络宁可保护线粒体内部结构，避免糖尿病所致的线粒体结构破坏，这可能是糖络宁治疗DPN的机制之一。
总之，高血糖状态下，神经细胞中线粒体会发生明显改变，其内部结构严重破坏，DNA表达过度升高，DNA的氧化损伤也非常明显。糖络宁作为一个疗效显著的中药复方可明显改善线粒体在高血糖下的上述改变，减低DNA表达，减少氧化损伤，缓解线粒体结构的破坏，这是糖络宁治疗DPN的机制之一。
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（收稿日期：2016-01-03 本文编辑：张瑜杰）