结肠癌癌细胞论文

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1、细胞转染

严格按照Lipofectamine2000试剂说明书操作，采用阳离子脂质体法进行病毒包装。转染前24h，将处于对数生长期的HEK293T接种于6孔培养板中，每孔2×105个细胞。使用含10%进口胎牛血清的高糖型DMEM细胞培养基在37℃、5%CO2条件下培养24h，待细胞融合度到70%～90%后进行病毒包装，分为pGIPZ-mir-126转染组、空白对照组(pGIPZ)。将两组病毒上清分别感染SW480细胞，感染72h后，荧光显微镜下观察到感染成功的细胞中绿色荧光蛋白(GFP)发绿色荧光，成功转染细胞后利用流式细胞仪分选GFP阳性的SW480细胞。分选的细胞纯度达95%以上，然后置于37℃5%CO2的培养箱中培养。

2、CCK-8检测结肠癌细胞的增殖能力

在96孔板中按每孔2×103细胞配制100ml的细胞悬液，每组设3个复孔，在37℃5%CO2的条件下将培养板在培养箱预培养24h;向培养板各加入10ml转染组与对照组细胞;将培养板在培养箱孵育一段适当的时间后，向每孔加入10mlCCK-8溶液，将培养板在培养箱内继续孵育2h;取细胞转染后12h、24h、48h三个时间点进行CCK-8检测，使用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其吸光度，重复3次。1.3.6划痕实验观察细胞迁移能力将两组细胞分别接种于6孔板，放入37℃5%CO2培养箱中孵育。待长至临近饱和时，用10μl微量移液头消毒后在细胞板上垂直划痕，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。倒置显微镜下每隔24h观察各组细胞的迁移情况并拍照。

3、Transwell实验观察细胞侵袭能力

小室接种细胞前2h将基质胶Matrigel用无血清的rPMI1640培养基稀释成浓度为1∶5，每个小室加50μl，放入37℃5%CO2培养箱中孵育2h;接种200μl无血清培养基细胞(5×105/ml)，下室加入600μl含10%胎牛血清的rPMI1640培养液。37℃5%CO2条件下培养24～48h后，取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定下室面，结晶紫染色，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗涤。显微镜下随机选取4个高倍视野计数穿过膜的细胞数，并计算平均值。实验重复3次。1.4统计学方法利用SPSS16.0软件进行χ2及t检验。

4、结果

结肠癌组织中mir-126表达阳性率显著低于癌旁正常黏膜组织(P＜0.05)。见表1。并且，mir-126的表达与年龄、性别及分化程度无明显相关性(P＞0.05)，与结肠癌临床分期、有无淋巴结转移显著相关(P＜0．05)。见表2。mir-126表达对结肠癌细胞生物学行为的影响mir-126表达对SW480细胞生长的影响随培养时间的延长，转染组细胞增殖能力明显低于空白对照组。见表3。mir-126表达对SW480细胞迁移能力的影响对SW480两组细胞划痕处理后，间隔24h连续观察细胞的迁移情况，可见空白对照组划痕72h后，细胞已基本完全覆盖划痕区域，而转染组则未完全覆盖。表明mir-126具有抑制结肠癌细胞迁移的能力。mir-126表达对SW480细胞侵袭能力的影响铺有基质胶的细胞培养36h后，转染组及空白对照组细胞迁移至下室的细胞个数分别为(10±4.81)个和(262±31.26)个;无基质胶的细胞在培养36h后计数迁移至下室的细胞数目，转染组和空白对照组分别为(81±14.27)个和(341±24.23)个，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

5、讨论

mirNAs在细胞增殖、迁移、侵袭、基因调控及肿瘤的转移等多种生物过程中起着十分重要的作用〔7，8〕。在分析这些mirNA分子的生物学功能时，发现mir-126与多种肿瘤的发生发展密切相关，并有研究报道其在结肠癌组织中表达下调〔9〕。前期研究发现，mir-126具有抑制结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭的能力，可见在结肠癌发生侵袭转移的过程中mir-126发挥举足轻重的作用〔10，11〕。本实验结果说明mir-126可以明显抑制细胞增殖，发挥抑制肿瘤生长的作用。同时，mir-126可抑制结肠癌细胞迁移能力及侵袭能力，发挥抑制结肠癌侵袭转移的功能。综上所述，在结肠癌中存在mir-126表达下调，其下调与结肠癌是否发生侵袭转移密切相关。体外实验也证实mir-126可通过抑制结肠癌细胞增殖、转移与侵袭而发挥抑瘤作用，为结肠癌转移抑制性mirNA。