UPLC―MS/MS法测定妇科调经片中芍药苷、阿魏酸和延胡索乙素的含量

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【摘 要】目的：建立uplc-ms/ms法测定妇科调经片中芍药苷、阿魏酸和延胡索乙素的含量。方法：采用BEH C18色谱柱（ 2.1mm×150mm，1.7 μm），以乙腈-0.05%甲酸铵的0.1%甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为0.25 mL・min-1，进样量2 μL，柱温45 ℃，采用电喷雾离子源进行正负离子模式同步检测，多反应监测模式（MRM）用于定量测定。结果：芍药苷、阿魏酸和延胡索乙素的线性范围分别为4.47～143.00 μg・mL-1（r=0.9999），3.19～102.00μg・mL-1（r=0.9996）和2.57～82.00 μg・mL-1（r=0.9998），其回收率分别为98.35%（RSD=1.85%）、100.19%（RSD =2.15%）和97.66%（RSD=1.78%）。结论：该方法简便，准确，重现性好，专属性高，可用于妇科调经片的质量控制。

【关键词】液质联用法;妇科调经片;芍药苷;阿魏酸;延胡索乙素

妇科调经片是中国药典2010年版一部收载的品种[1]，具有养血柔肝，理气调经的功效，用于肝郁血虚所致的月经不调、经期前后不定、行经腹痛，临床应用广泛，疗效确切。《中国药典》2010年版以当归、川芎中的阿魏酸作为其质量控制的主要指标，而对其他药味缺乏含量测定指标，难以全面准确地评价妇科调经片质量。通过查阅文献[2-3]，目前也仅有采用高效液相色谱法测定妇科调经片中芍药苷、延胡索乙素等单一成分的报道。因此，研究建立妇科调经片多个主要成分的含量测定方法，对提高妇科调经片的质量控制标准具有重要的应用意义。液质联用法由于专属性强、灵敏度高，已经越来越多地应用于中药及其制剂的质量控制研究中[4-6]。故本实验采用UPLC-MS/MS法对妇科调经片中芍药苷、阿魏酸和延胡索乙素的含量测定方法进行了研究，为有效控制妇科调经片的质量提供了科学依据。

1 仪器与试药

ACQUITYTM系统超高液相色谱-三重四级杆串联质谱仪（美国Waters公司，包括二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、三重四级杆质量分析器和Masslynx4.1质谱工作站）。

芍药苷（批号110736-200320）、阿魏酸（批号110773-9910）和延胡索乙素（批号0726-200208）对照品均购自中国药品生物制品检定所。妇科调经片（市售品，广西某厂家，批号：090803，河南某厂家，批号：290006;湖北某厂家，批号： 090213）。乙腈、甲酸为色谱纯;水为纯净水;其他试剂均为分析纯。阴性样品自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

WATERS ACQUITY BEH Cl8色谱柱（2.1mm×150mm，1.7μm）;流动相：乙腈-0.05%甲酸铵的0.1%甲酸溶液，线性梯度洗脱程序见表1;流速为0.25mL・min-1;柱温为45 ℃;进样量为2 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序表

2.2 质谱条件

离子源电喷雾电离源（ESI）;毛细管电压3.5 kV;离子源温度125℃;去溶剂气N2，流速800 L・h-1;去溶剂气温度360℃;离子源温度115℃;碰撞气Ar，流速0.18 mL・min-1;检测模式多反应离子监测（MRM）;监测离子对m/z（-） 525121（芍药苷）;m/z（-） 193134（阿魏酸）;m/z（+） 356192（延胡索乙素）。

2.3 供试品溶液的制备

取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。同法，制得缺当归、川芎、白芍、赤芍、醋延胡索的阴性样品溶液。

2.4 对照品溶液的制备

精密称取芍药苷、阿魏酸和延胡索乙素对照品适量，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成每毫升含芍药苷0.143mg、阿魏酸0.102 mg和延胡索乙素0.082mg的对照品混合液，摇匀，即得。

2.5 专属性试验

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各1μL，分别进样，结果见图1。供试品溶液中被测定化合物与3个对照品的保留时间相同。比较被测定成分和对照品的母离子、子离子质谱图，两者一致，且阴性样品溶液在芍药苷、阿魏酸和延胡索乙素色谱峰处无干扰，表明本法专属性良好。

图1 对照品溶液（A）;样品溶液（B）;阴性样品溶液（C）

注：1.芍药苷;2.阿魏酸;3.延胡索乙素.

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察

分别精密吸取上述混合对照品储备液，依次用甲醇逐级稀释，制得5个浓度的系列浓度线性工作液，分别进样测定。以色谱峰峰面积（ Y ）为纵坐标，以对照品浓度（ X ）为横坐标进行线性回归，芍药苷、阿魏酸和延胡索乙素的线性回归方程分别为：Y=4934909X-7794 r= 0.9999;Y=7287380X-11541r=0.9996;Y=4944101X+1346r=0.9998;结果表明芍药苷、阿魏酸和延胡索乙素浓度分别在4.47～143.00，3.19～102.00，2.57～82.00 μg・mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.6.2 精密度试验

取混合对照品溶液重复进样 6次，测定峰面积。芍药苷、阿魏酸和延胡索乙素峰面积的 RSD（n=6）为0.86%，0.43%，1.02%。结果表明，仪器精密度良好。

2.6.3 重复性试验

精密称取同一批妇科调经片样品（批号090803），共6份，按“供试品溶液”项下方法操作，在上述色谱条件下进样，芍药苷、阿魏酸和延胡索乙素的平均含量（n=6）分别为0.78 mg・g-1，0.23 mg・g-1，0.62 mg・g-1;RSD（n=6 ）分别为2.16%，1.87%，1.53%。结果表明，重复性良好。

2.6.4 稳定性试验

取同一批妇科调经片样品（批号090803），分别在0，1，2，4，8，12 h进样分析，测得芍药苷、阿魏酸和延胡索乙素峰面积的RSD（ n = 6 ）分别为0.81%，2.03%，1.76%。结果表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.6.5 回收率试验

精密称取6份已知含量的妇科调经片样品（批号090803）约0.5g，分别精密加入74.4μg・mL-1芍药苷、25.4μg・mL-1阿魏酸和64.8μg・mL-1延胡索乙素混合对照品溶液5 mL，按供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，分别进样测定，计算回收率及RSD，结果见表2。

表2 回收率测定结果（n=6）

2.7 样品测

取不同厂家生产的3批妇科调经片，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液。精密吸取对照品溶液及供试品溶液各2μL，进样测定，测定结果见表3。

表3 3批样品含量测定结果（mg/片）

3 讨论

（1）妇科调经片处方由当归、川芎、醋香附、麸炒白术、白芍、赤芍、醋延胡索、熟地黄、大枣、甘草十味中药材组成。当归、川芎中所含的阿魏酸具有抗血小板聚集，抑制血小板5-羟色胺释放，镇痛，缓解血管痉挛等作用。白芍、赤芍中所含的芍药苷具有扩张血管、镇痛镇静、抗炎抗溃疡、解热解痉等作用。醋延胡索中所含的延胡索乙素具有镇痛、镇静、催眠及安定等作用。因此，本文结合妇科调经片处方药味的主要化学成分及其药理作用，选择阿魏酸、芍药苷和延胡索乙素作为其质量控制指标，可较为全面准确地控制妇科调经片质量。

（2）实验中分别应用HPLC和UPLC-MS/MS测定了妇科调经片的含量，结果表明，UPLC-MS/MS灵敏度更高，专属性强，样品处理简单，且由于UPLC使用1.7μm颗粒度的色谱柱填料，能显著提高分离的效率从而达到显著缩短分析时间的目的。因此，UPLC-MS/MS应用于中药复杂体系的分析测定有着非常广阔的应用前景。

（3）对市场上3个厂家的妇科调经片分析结果表明，不同厂家生产制剂中所含的芍药苷、阿魏酸和延胡索乙素含量存在明显差异，可能由于不同厂家的原料药材来源和质量有差异所致。上述结果提示，为保证不同批次间妇科调经片质量的一致性，应加强对原料药材的质量控制，必要时固定药材的来源。

【参考文献】

[1]国家药典委员会，编.中国药典：一部[M].2010：730.

[2]邵志伟.HPLC法测定妇科调经片中芍药苷的含量[J].安徽医药，2007，11（5）：418.

[3]周作光.HPLC测定妇科调经片中延胡索乙素的含量[J].广西中医学院学报， 2007，10（4）：77.

[4]黄勇，何峰，张治蓉，等.HPLC-MS-MS同时检测大鼠血浆中荭草素、牡荆素和槲皮苷[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（1）：80-83.

[5]解军波，张彦青，吴国娇，等.LC-MS/MS法测定独一味中木犀草素[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（7）：64-66.