三七总皂苷制剂致类过敏反应的相关机制研究

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[摘要]探究三七总皂苷制剂诱发类过敏反应的病理特点以及致类过敏反应的物质基础。采用小鼠类过敏试验模型，适应性饲养1 d后，将雄性ICR小鼠随机分成5个实验组，分别为空白组、阳性对照组、三七总皂苷制剂低、中、高剂量组，每组10只，一次性静脉注射含0.4%伊文思蓝（EB）的相应受试物，给药30 min后，记录各组动物耳廓蓝染数，进行耳廓蓝染程度评分，并定量测定耳廓EB渗出量。另做2批动物，只给予相应的受试物，30 min后，取外周血和肺脏，用ELISA法检测血清中相关的细胞因子，肺脏HE染色。结果表明，三七总皂苷制剂中、高剂量静脉注射均可引起小鼠耳廓血管通透性增高，耳廓明显蓝染，提示可能有致类过敏的作用。病理结果显示三七总皂苷制剂的类过敏反应与炎症反应密切相关，肥大细胞脱颗粒现象明显。组胺、VEGF以及TNF-α的含量在三七总皂苷制剂中、高剂量时明显升高（P<0.05，P<0.01）且呈现出剂量依赖关系，与耳廓蓝染程度保持一致，而IL-6和IL-10含量在三七总皂苷制剂低、中剂量时没有明显升高，当其增为临床4倍浓度8倍剂量时较空白组均明显升高（P<0.05，P<0.01）。其产生类过敏作用可能与组胺，VEGF，TNF-α有关，但可能当其类过敏程度达到一定高的程度时，IL-6和IL-10才可能在类过敏反应中发挥作用。

[关键词]类过敏反应;三七总皂苷制剂;物质基础;血管通透性

Material for evaluation of notoginseng total saponin preparation

induced pseudoanaphylactoid reactions

YU Ting-ting1，2，3， LI Jie2， ZHAO Jia-wei2， ZHANG Ya-xin2， LI Dan-dan2， LIANG Ai-hua4， LIU Guan-ping5， GAO Shan3， GAO Yue2*

（1. Functional Laboratory Centre， Basic Medical College， Wannan Medical College， Wuhu 241002， China;

2.Institute of Radiation Medicine， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China;

3.Department of Pharmacology， Basic Medical College， Anhui Medical University， Hefei 230032， China;

4. Institute of Chinese Meterial Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China;

5.GuangXi Wuzhou Pharmaceutical （Group） Co.， Ltd.， Wuzhou 543000， China）

[Abstract]The experiment is designed to explore pathological festures and material basis of pseadoanaphylactoid reaction induced by notoginseng total saponin preparation. Mouse pseadoanaphylactoid reaction was used， 50 ICR mice were randomly assigned to control group， positive medicine group， notoginseng total saponin preparation low-dose group， notoginseng total saponin preparation middle-dose group， notoginseng total saponin preparation high-dose group on average. They are treated by intravenous injection of test substance solutions containing 0.4% Evans blue （EB）. 30 min later， scores of ear blue staining and quantitation of ear EB exudation were recorded. Another two experiment were repeated in the same way excluding EB， just to detect the related cytokines in serum using ELISA. We found that the scores of pseudoanaphylactoid reaction in notoginseng total saponin preparation injection middle-dose group and high-dose group was evidently higher than that in control group， suggesting that notoginseng total saponin preparation injection may be can lead to pseadoanaphylactoid reaction. HE staining showed that pseadoanaphylactoid reaction induced by notoginseng total saponin preparation injection is related to inflammation. Histamine， VEGF and TNF-α levels in notoginseng total saponin preparation middle-dose group and high-dose group significantly increased（P<0.05， P<0.01）than control group and showed a dose-dependent manner as well as consistent with the degree of ear blue dye. While IL-6 and IL-10 content did not increase significantly in notoginseng total saponin preparation low-dose group and middle-dose group， but they significantly higher than control group（P<0.05， P<0.01）when it increased to quadrupe clinical concentrations， eight times of the clinical dose. So pseadoanaphylactoid reaction caused by notoginseng total saponin preparation may be related to histamine， VEGF， TNF-α， and it is possible that IL-6 and IL-10 can play a role when pseadoanaphylactoid reaction achieve a certain high degree.

[Key words]pseadoanaphylactoid reactions; notoginseng total saponin preparation; material basis; vascular permeability

doi：10.4268/cjcmm20151410

三七总皂苷制剂为三七总皂苷（主根）制成的单方制剂，具有活血祛瘀，通脉活络的功效，主要用于瘀血阻络、中风偏瘫、胸痹心痛及视网膜中央静脉阻塞症^[1]。药物急性过敏反应是临床常见的不良反应，其主要类型是Ⅰ型变态反应，即由IgE介导的抗原抗体复合物引起的免疫反应。然而临床上使用的许多药物首次进入人体后，不经过潜伏期，无抗原抗体结合，患者血清的IgE浓度也未见升高，却仍然迅速发生与Ⅰ型变态反应相同的反应症状。因此，Dukor^[2]称之为假药物变态反应，或类过敏反应。最新调查研究表明，随着中药注射剂的广泛应用，77%的急性过敏反应为类过敏反应，其发生率远高于Ⅰ型变态反应^[3]，所以类过敏反应越来越受到人们的关注。本文研究探讨了三七总皂苷制剂致类过敏反应的病理特点以及物质基础，为评价三七总皂苷制剂的安全性提供参考，为进一步研究三七总皂苷制剂致类过敏反应的可能机制奠定基础。

1材料

1.1动物成年健康ICR小鼠，体重22～25 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京）2012-0001。小鼠饲养在北京军事医学科学院实验动物中心，温度控制在20～25 ℃，相对湿度（55±15）%，每小时通风10次，人工控制照明，12 h昼夜交替。

1.2药物与仪器三七总皂苷制剂（批号13060112）;伊文思蓝（Wako，批号WEM1828）;生理盐水（石家庄四药有限公司，批号131231730）;甲酰胺（国药集团化学试剂有限公司，批号20130122）;Compound 48/80（Sigma公司，批号073M4050V）;组胺ELISA试剂盒（R&D Systems，批号CK-E20452M）;VEGF ELISA试剂盒（R&D Systems，批号CK-E20260M）;IL-6 ELISA试剂盒（R&D Systems，批号CK-E20012M）;IL-10 ELISA试剂盒（R&D Systems，批号CK-E20005M）; TNF-α ELISA试剂盒（R&D Systems，批号CK-E20220M）;动物天平（Sartorius，德国，型号BSA3202s ）;酶标仪（美国Thermo，型号varioskan flash）。

2方法

2.1耳廓血管通透性增高现象观察动物到达后先适应性观察1 d，实验当天，50只小鼠按动物体重随机分为生理盐水对照组、阳性药Compound 48/80组（25 mg・kg-1）、三七总皂苷制剂低、中、高剂量组（100，200，400 mg・kg-1）。根据此公司三七总皂苷制剂产品说明书上的用法用量，将三七总皂苷制剂的临床拟用量换算成小鼠等效剂量约为50 mg・kg-1，三七总皂苷制剂的低、中、高剂量相当于临床剂量的2，4，8倍。以上各受试物中均含有0.4%的伊文思蓝，各组小鼠经尾静脉注射相应受试物，给药体积为20 mL・kg-1，观察给药后30 min小鼠的行为学变化及耳廓蓝染情况。记录每组出现耳廓蓝染的动物数、蓝染总耳数、耳廓蓝染面积。耳廓蓝染面积（S）按照分级评估，0分：双耳无蓝染;1分：0

2.2三七总皂苷制剂类过敏反应的物质及组织病理特点研究分组和步骤与上述基本一致，不同的是，此次各受试物中均不加伊文思蓝染料，给药30 min后，摘眼球取血，然后离心取上清-80 ℃冻存以检测相关的细胞因子，同时取耳和肺组织，浸泡在10%福尔马林溶液中，用来做HE染色。

2.3用ELISA法检测相关的细胞因子往预先包被相应细胞因子抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的相应细胞因子呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，计算样品浓度。

2.4统计分析根据每组发生耳廓蓝染的动物数计算各组血管反应阳性率（简称反应率）;根据蓝染耳数计算耳蓝染率。统计采用卡方检验。耳廓蓝染面积采用非参数检验。各组的伊文思蓝渗出数据均以±s表示，各给药组分别与对照组进行比较，用SPSS 11.0统计软件ANOVA程序进行方差分析。

3结果

3.1三七总皂苷制剂对小鼠耳廓蓝染与血管通透性增高反应的影响三七总皂苷制剂可导致血管通透性增高，并呈现明显的剂量关系，其中200 mg・kg-1和400 mg・kg-1组在小鼠上均可引起肉眼可判断较明显的耳廓蓝染，耳蓝染评分和EB渗出量均较对照组显著增高（P<0.05或P<0.01），三七总皂苷制剂100 mg・kg-1组表观表现不是很稳定。且EB定量测定结果与耳廓蓝染程度基本保持一致，见表1。

3.2三七总皂苷制剂对小鼠耳、肺组织形态的影响Compound 48/80组耳廓厚度较对照组明显变厚，耳组织内可见明显水肿，三七总皂苷制剂各用药组均呈现出轻度水肿;可见少数炎性细胞浸润，有肥大细胞脱颗粒现象，见图1。Compound 48/80组和三七总皂苷制剂组小鼠肺组织毛细血管充血，肺泡间隔增宽，炎性细胞浸润，提示三七总皂苷制剂的类过敏反应表现出明显的炎症反应，并且，发现随着药物剂量的增高而出现炎症加重的现象，见图2。

3.3三七总皂苷制剂对小鼠血清中相关细胞因子的影响与空白组相比，阳性药静脉注射后可导致血液组胺、VEGF以及IL-10含量明显增高（P<0.01，P<0.05），TNF-α和IL-6含量有所增高，但未见显著性差异。三七总皂苷制剂200 mg・kg-1及400 mg・kg-1用药组的组胺、VEGF以及TNF-α含量较对照组明显增高（P<0.01，P<0.05），而IL-6及IL-10含量在三七总皂苷制剂400 mg・kg-1时较对照组差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05），且结果显示这些细胞因子含量均呈现出剂量依赖性关系，这与小鼠耳廓蓝染即类过敏程度保持一致，见图3。

4讨论

三七总皂苷制剂是从中药三七主根提取有效成分制成的中药注射剂，主要成分是三七总皂苷。近年来广泛应用于心脑血管系统、内分泌系统、呼吸系统等多系统，以及外科、骨科、眼科等多科疾病的治疗^[3-4]。随着临床应用的增多，其不良反应的报道逐渐增加，大量的临床资料表明，三七总皂苷制剂所致的不良反应主要以皮肤反应为主，严重者可出现呼吸困难或过敏性休克等，其中大部分都属于类过敏反应，并且男性多于女性^[5-7]。

目前，我国SFDA中有关类过敏实验的评价标准尚未制定，所以建立有效的类过敏实验动物模型和实验评价标准对类过敏研究至关重要。至今，已有很多学者致力于类过敏反应的研究，一般认为类过敏的发生可能与致敏物质直接刺激肥大细胞释放组胺等炎性介质有关^[8]。梁爱华等根据SFDA《中药、天然药物免疫毒性（过敏性、光变态反应）研究技术指导原则》^[9]及类过敏实验反应特征，建立了啮齿类动物（小鼠、豚鼠）血管通透性增高为主要特

从上往下分别为对照组、阳性药组、三七总皂苷制剂低、中、高剂量组（图2同）。

点的类过敏试验模型，以血管通透性增高的定性和定量测定作为小鼠类过敏试验评价指标^[10-12]。本次实验的结果显示，三七总皂苷制剂静脉注射给药后，200 mg・kg-1以及400 mg・kg-1 （浓度是10，20 g・L-1，分别相当于临床用药浓度的2，4倍，临床剂量的4，8倍）组在雄性小鼠上均可引起耳廓血管通透性明显增高，可见三七总皂苷制剂具有导致类过敏反应的可能，且其反应程度与剂量成正比。从小鼠的病理组织学结果来看，三七总皂苷制剂致小鼠类过敏反应主要以炎性病变为主，且其炎症反应由轻到重排序为：空白组

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