半叶马尾藻多糖对辐射损伤小鼠免疫功能的保护作用
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作者：宋云端 秦维超 吕涛, 孟庆勇
【摘要】
目的探讨半叶马尾藻多糖［sargassum hemiphyllum (turner) c.ag，shp］对辐射损伤小鼠免疫功能的影响。方法选取74mbq的32p-玻璃微球（32p-gms）肿瘤内照射导致荷瘤小鼠辐射损伤，通过流式细胞术、分光光度法、酶释放法测定不同浓度的shp对辐射损伤小鼠免疫功能的保护作用。结果照射组荷瘤小鼠免疫功能明显低于正常对照组（p＜0.01）；200，400，800 mg/kg shp口服灌胃加照射组荷瘤小鼠免疫功能明显高于照射组（p＜0.01）。结论74mbq的32p-gms肿瘤内照射可以抑制小鼠的免疫功能，shp对辐射损伤小鼠的免疫功能有保护作用。
【关键词】 半叶马尾藻多糖 辐射损伤 免疫功能 保护作用
abstract:objectiveto investigate the effect of sargassum hemiphyllum (turner) c.ag polysaccharides (shp) on the immune function in radiation damaged rats.methodsintratumoral irration with 74mbq 32p-gms generate radiation damage in tumor-bearing rats, and flow cytometry, photometry and lactic acid dehydrogenase release assay were adopted to detect the protective effect of different-dose shp on the immune function in radiation damaged rats. resultsimmune function of radiation group in tumor-bearing rats was obviously lower than that of normal control group（p＜0.01）.the immune function in shp（200，400，800 mg/kg）for oral use plus radiation group was obviously higher than that of normal control group（p＜0.01）. conclusionintratumoral irration with 74mbq 32p-gms can restrain immune function in tumor-bearing rats，and shp has protective effect on the immune function in radiation damage rats.
key words:sargassum hemiphyllum (turner) c.ag polysaccharides (shp); radiation damage; immune function; protective effect
许多海洋生物体内存在着各种抗肿瘤、抗病毒和用于 治疗 心、脑血管疾病的多糖类活性物质，引起了世界各国对研究开发海洋多糖类药物的关注［1］。为寻找天然低毒高效的抗辐射免疫调节剂,本研究以32p-gms肿瘤内照射辐射损伤小鼠为模型，观察半叶马尾藻多糖对小鼠辐射损伤的保护作用，探讨半叶马尾藻多糖的生物学作用，为开发具有辐射保护功能的天然物质提供理论依据。
半叶马尾藻sargassum hemiphyllum (turner) c.ag.隶属于褐藻门,是我国广东、浙江、 台湾 沿海藻类养殖品种之一。目前,半叶马尾藻对生理调节作用的研究报道较少。为开发半叶马尾藻的应用价值,笔者探讨了半叶马尾藻多糖对辐射损伤小鼠免疫功能的影响。
1 材料与仪器
1.1 动物昆明小鼠,雄性，spf级，6～10周龄,体重(20±2)g，广东医学院动物中心提供。
1.2 材料与试剂半叶马尾藻（采自广东省湛江市硇洲岛海域）；小鼠s180肉瘤、小鼠t淋巴细胞瘤细胞（购于中山大学医学院实验动物中心）；rpmi-1640培养基(美国gibco公司)；小牛血清(杭州四季青公司)；32p-玻璃微球(成都中核高通同位素股份有限公司)；fitc -cd3、pe-cd4、pe-cd8（美国biolegend公司）；2-me（上海第四试剂厂）。
2 方法
2.1 多糖的提取半叶马尾藻多糖(shp)为本实验室提取：半叶马尾藻洗净、干燥粉碎, 水煮乙醇沉淀法粗提，胰酶联合sevag法去蛋白，凝胶过滤柱层析进一步纯化后得到半叶马尾藻多糖真空干燥为灰白色粉末。用生理盐水配制成10%的shp原液,10磅10 min高压消毒。用rpmi-1640培养液配制成终浓度为200,400,800 mg/kg终浓度的多糖溶液。
2.2 造模方法无菌条件下取1×106 s180细胞接种于每只小鼠右前肢鼠鼷部。
2.3 动物分组及给药方法小鼠50只,其中正常组（a组）取10只,其余均按上法造模。造模7 d后按随机区分组法将40只小鼠分为照射对照组和shp 3个不同剂量加照射组（分别为b、c、d、e组），每组10只。正常对照组和照射对照组每只灌胃生理盐水,3个不同shp剂量加照射组小鼠分别灌胃20,40,80mg/ml的shp溶液，各组小鼠均连续灌胃14 d。b、c、d、e组小鼠第15天均一次性瘤体注射74mbq的32p-玻璃微球。
2.4 标本采集照射后24 h,摘小鼠眼球取血，剥离肿瘤组织并无菌取脾。
2.5 检测指标
2.5.1 小鼠细胞免疫功能的测定［2］取50 μl脾细胞悬液和1 ml的pbs加入到离心管中,离心去上清。依次取 10 μl的fitc -cd3、pe-cd4和pe-cd8加入离心管中,混匀避光反应 30 min,1 500 r·min－1，离心5 min，洗涤2次后，加入300 μl固定液用流式细胞仪测cd3、cd4、cd8细胞数。
2.5.2 小鼠体液免疫功能的测定［3,4］在用shp第9天，每只小鼠腹腔注射5%绵羊红细胞悬液0.2 ml进行免疫。在第14天摘眼球取血，离心，取血清。将每只小鼠的血清分成两份，一份不作任何处理，一份加等量2-me，在37℃水浴保温30 min以破坏其中的igm，再分别将两份血清作800倍稀释。
igg溶血素测定：取2-me处理血清0.5 ml和5%srbc0.5 ml充分混匀，再加羊抗小鼠igg和1∶10稀释的补体各0.5 ml，空白管以0.5 ml生理盐水代替血清。
igm溶血素测定：未处理血清、5％的srbc、1∶10稀释的补体及生理盐水各0.5ml混合于试管中，空白管以生理盐水代替血清。所有试管37℃水浴1h（中间摇动一次），3 000 r·min－1，离心10 min，取上清，酶标仪在 540 nm波长处测定上清液的吸光度值。
根据以下公式 计算 各型溶血素含量（hemolysin concentration），其中包括igg溶血素（hcigg）、igm溶血素（hcigm）和总溶血素（hctotal）值。
hcigg＝2-me处理血清的od值×稀释倍数
hcigm＝未处理血清的od值×稀释倍数
hctotal＝hcigg＋hcigm
2.5.3 小鼠的非特异性免疫功能测定［5,6］用rpmi-1640培养液分别调整小鼠脾细胞(效应细胞)和体外培养的小鼠t淋巴细胞瘤细胞(靶细胞)浓度分别为5×106/ml和1×105/ml。按效∶靶=50∶1比例,各取100 μl加入96孔平底培养板,37℃,5%co2条件下共同培养4 h。并设 自然 释放和最大释放组作为实验阴性与阳性对照。然后1 000 r/min离心5 min。吸取上清100 μl,加入乳酸脱氢酶100 μl,避光反应15 min。再加入1 mol/l柠檬酸终止酶促反应,570 nm波长读取od值。 计算 nk细胞活性。
2.5.4 统计学处理用sas8.0软件进行方差齐性检验，然后进行完全随机设计方差分析，组间差异的显著性用q检验，多个样本均数与对照组样本均数之间比较用t检验。
3 结果
3.1 半叶马尾藻多糖对辐射损伤荷瘤小鼠细胞免疫功能的影响从表1可以看出,b组荷瘤小鼠接受74mbq照射后, t淋巴细胞亚群cd3、cd4和cd8表达显著低于a组（p<0.01）。c、d、e组荷瘤小鼠经过灌胃不同剂量的shp,再接受74mbq照射后, c、d、e组荷瘤小鼠t淋巴细胞亚群cd3、cd4、cd8表达显著高于b组（p<0.01）。各组荷瘤小鼠t淋巴细胞亚群cd4/cd8差别有统计学意义（p<0.01）。表1 shp对辐射损伤荷瘤小鼠细胞免疫功能的影响（略）与a组比较，##p<0.01;与b组比较，**p<0.01；n=10
3.2 半叶马尾藻多糖对辐射损伤荷瘤小鼠体液免疫功能的影响从表2可以看出, b组荷瘤小鼠接受74mbq照射后, 血清溶血素含量（hcigm、hcigg和hctotal）显著低于a组（p<0.01），c、d、e组荷瘤小鼠经过灌胃不同剂量的shp,再接受74mbq照射后,血清溶血素含量（hcigm、hcigg和hctotal）显著高于b组（p<0.01）。表2 shp对辐射损伤荷瘤小鼠体液免疫功能的影响（略）与a组比较，##p<0.01;与b组比较，**p<0.01；n=10
3.3 半叶马尾藻多糖对辐射损伤荷瘤小鼠非特异性免疫功能的影响从表3可以看出, b组荷瘤小鼠接受74mbq照射后48 h,nk细胞活性显著低于正常对照组（p<0.01）, c、d、e组荷瘤小鼠经过灌胃不同剂量的shp,再接受74mbq照射,荷瘤小鼠nk细胞活性显著高于b组（p<0.01）。
4 讨论
放射 治疗 肿瘤已成为首选治疗各种恶性肿瘤的方法，特别是对手术不能切除的肿瘤。但放疗缺乏特异性，在杀死肿瘤细胞的同时，也损伤正常细胞，特别是对免疫系统和造血组织的损伤尤为严重。 现代 医学认为,机体的免疫功能与肿瘤的发生和 发展 有密切关系。当宿主免疫功能低下或受抑制时,肿瘤发生率增高,而在肿瘤进行性生长时肿瘤患者的免疫功能受抑制,二者也互为因果［7］。因此,如何增强机体免疫功能,更好地发挥机体的抗肿瘤免疫机制,是多年来肿瘤免疫学研究的重要课题。表3 shp对辐射损伤荷瘤小鼠非特异性免疫功能的影响（略）与a组比较，##p<0.01;与b组比较，**p<0.01；n=10
大量研究证明, 从各种生物体内提取大量活性多糖,发现多糖具有明显的抗辐射作用,能显著延长辐射损伤肌体的存活时间,提高存活率,拮抗辐射引起的免疫功能低下,降低造血系统的损害,清除氧自由基，其中尤以免疫调节作用成为近年来研究开发的热点［8］。海藻多糖对机体的特异性和非特异性免疫都有影响,且有的具有双向免疫调节作用。
本次研究结果表明，74mbq32p-玻璃微球可以抑制小鼠的免疫功能。表现为b组荷瘤小鼠的t淋巴细胞亚群cd3、cd4和cd8表达、血清溶血素含量和nk细胞活性显著低于a组（表1～3）。cd3+t淋巴细胞的数量直接反应了外周免疫器官中总t细胞数量水平［9］。shp不仅可以有效阻止辐射引起的t细胞数量减少、拮抗辐射引起的溶血素减少，也可以增强辐射损伤荷瘤小鼠nk细胞杀伤靶细胞的能力。表明shp可以有效缓解辐射引起的细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫功能低下。孟庆勇等［10］发现麒麟菜多糖可以使辐射损伤的小鼠g1期脾淋巴细胞数量减少,s期和g2/m期增加,表明马尾藻多糖能促进辐射损伤淋巴细胞的增殖,与本实验结果一致。从表1～3可以看出，shp可以有效预防32p-玻璃微球肿瘤内照射的辐射损伤，表现在各表的c～e组的值均比照射组高，说明shp能显著提高辐射损伤小鼠的免疫功能。
以上研究结果表明半叶马尾藻多糖能减轻辐射对机体的免疫损害,提高照射后受损的免疫功能,为海藻多糖成为肿瘤放疗患者的辅助治疗而应用于临床提供了实验依据。药 理学 研究初步显示海藻多糖有良好的抗辐射效应,但多糖作用的有效部位、作用靶点、作用机制等还有待进一步研究。海藻多糖拮抗辐射损伤功能与其结构(含一级结构乃至空间结构)有关。不同提取方法对结构的影响不同,会造成生物活性的差异。因此，在进行多糖功能研究的同时,其分离纯化工艺和对结构的研究应同时进行。另外，海藻多糖辐射防护作用的分子机制有待深入研究。
【 参考 文献 】
［1］周 杰，陈安国. 海藻多糖的生物活性研究进展［j］.饲料 工业 ，2005，26（18）：12.
［2］周阿高，张 勇，孔德云,等. 黄芪解毒汤对荷瘤小鼠免疫调节作用的实验研究［j］.