鲁西黑头羊mtDNA D―loop区遗传多样性与遗传分化研究
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摘要： 鲁西黑头羊是一个优良的绵羊培育品种，具备高产肉力和高繁殖力特征。为了评估这个品种线粒体DNA的遗传多样性，同时获得该新品种界定的分子证据，本研究对鲁西黑头羊、杜泊羊和小尾寒羊mtdna的高变异区进行了测序，分析了它们的遗传多样性和遗传分化，并计算了鲁西黑头羊与其它两个品种间的遗传距离。结果表明：三个品种的遗传多样性较为丰富，遗传分化程度较高（Fst为 0.3240～0.5909）；鲁西黑头羊与杜泊羊之间的遗传距离为0.1187，达到了种间的遗传距离，与小尾寒羊之间的遗传距离为0.0654，达到了亚种间的水平。以上结果为鲁西黑头羊的品种界定提供了数据支持。
关键词：鲁西黑头羊；mtDNA；D-loop区；遗传多样性；遗传距离
中图分类号：S826.212文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）09-0115-04
AbstractLuxi black head sheep is an excellent cultivated breed with high yield of meat and high prolificacy. To assess the genetic diversity of Luxi black head sheep on mtDNA and obtain the molecular evidence on breed identification， the hypervariable regions of mtDNA in Luxi black head sheep， Dorper and small tail Han sheep were sequenced， and their genetic diversity， genetic differentiation and genetic distance were analyzed. The results indicated that the genetic diversity among three breeds was rich and the degree of genetic differentiation was high （Fst as 0.3240～0.5909）. The genetic distance between Luxi black head sheep with Dorper was 0.1187， which reached the value between species； and that with small tail Han sheep was 0.0654， which reached the value between subspecies. The results provided data support for the breed identification of Luxi black head sheep.
KeywordsLuxi black head sheep； mtDNA； D-loop region； Genetic diversity； Genetic distance
鲁西黑头羊是利用杜泊羊作父本、小尾寒羊作母本，经过级进杂交、横交固定、继代选育和扩繁而培育形成的肉用绵羊新品种。该品种头颈部被毛黑色，体躯被毛白色，体格大、结构匀称、背腰平直、后躯丰满，肉用体型明显；6月龄公羔体重达到（45.75±3.70） kg，6月龄母羔体重达到（43.76±6.03） kg；平均产羔率220%，屠宰率55.1%，具有生长速度快、繁殖率高、耐粗饲、羊肉品质好等优良特性，颇受市场欢迎。
动物线粒体DNA（Mitochondrial DNA， mtDNA）是动物体内唯一的核外遗传物质，具有母系遗传的特征，结构简单稳定、进化速度较快，而且能直观保存群体突变的发生[1，2]。Fan等[3]对不同尾型的绵羊mtDNA基因组进行了测序，分析了不同尾型品种间的系统进化关系。Zhao等[4]利用mtDNA测序方法分析了中国绵羊品种的遗传多样性和品种间遗传变异情况。本研究拟通过对鲁西黑头羊、杜泊羊和小尾寒羊mtDNA D-loop区进行测序，分析它们的遗传多样性和遗传变异，计算鲁西黑头羊与其它两个品种间的遗传距离，以期为鲁西黑头羊的品种界定提供数据支持。
1材料与方法
1.1样品采集
选择健康的无亲缘关系的羊群，随机抽测杜泊羊8只、小尾寒羊10只（后期有1只样品不能用）、鲁西黑头羊10只，均为成年羊，公母各半。利用EDTA抗凝管颈静脉采血5 mL，-20℃保存备用。
1.2试验方法
1.2.1基因组DNA提取采用生工生物工程（上海）股份有限公司的EZUP柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取血液基因组DNA。-20℃保存。
1.2.2PCR扩增本试验所使用的D-loop区引物序列，F： 5′-AGCCCCACTATCAACACC-3′；R： 5′-AAATAGTTACCCCCACAGTTAG-3′。
PCR扩增反应体系为25 μL，反应体系为：10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L） 2 μL、正向引物和反向引物（10 μmol/L）各为1 μL、DNA（10 ng/μL） 模板为1 μL、Taq酶（2.5 U/μL）0.5 μL、ddH2O 补足总体积到25 μL。PCR扩增条件为：94℃预变性 5 min；94℃变性30 s，56℃退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，30个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
1.2.3序列比对和分析PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送生工生物工程（上海）股份有限公司纯化和测序，测序结果用ChromasPro（version 1.7.4）进行拼接，拼接好的序列在NCBI中进行Blast比对，确保得到的序列是目标序列；然后用Clustal X[5]进行多重比对，并对比对结果进行筛查与纠正；采用DnaSP v5（version 5.10.01）软件[6]计算各碱基组成、单倍型多样度（Hd）、核苷酸多样性（Pi）、平均核苷酸差异数（k）、种群间核苷酸平均差异数（Kxy）、核苷酸歧义度（Dxy）、遗传分化系数（Gst）和固定系数（Fst）等分子遗传学参数，并进行中性检验；采用MEGA 4.0软件[7]，按照Kimura双参数法（two-parameter method）[8]，计算种间和种内的平均遗传距离，采用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，选用K2P替代模型，进行1 000次自举检验。
2结果与分析
2.1PCR扩增结果
以杜泊羊、小尾寒羊、鲁西黑头羊基因组DNA为模板对其D-loop区进行扩增，经电泳检测，条带与预期目标片段大小一致，随后进行纯化和测序。
2.2D-loop区序列碱基组成
测序结果经ChromasPro拼接后，除去引物部分，获得的D-loop区序列为735 bp，经在线Blast比较，证实所得序列为D-loop区片段。三个品种平均碱基含量见表1，G+C含量在35.1%～37.4%之间，A+T的含量明显高于G+C的含量，C含量最低，明显低于其它3种碱基的含量。
系统发生树（NJ 法）
3讨论与结论
线粒体基因组是母系遗传，基因进化速率较快，种群之间的遗传差异易被检出，线粒体基因组中的控制区D-loop区不编码基因，受到的选择压力较编码基因小，其进化速率是其他区段的5倍[9]，因此常用于研究种及以下水平的遗传分化，以获得较多的遗传变异信息。四种碱基在线粒体基因组中的分布呈不均一性，本研究所测定的三个品种的D-loop序列，其T、C、A、G的平均含量分别为36.1%、13.1%、27.6%、23.1%，A+T含量（63.7%）高于G+C（36.3%），符合脊椎动物mtDNA碱基组成的特点。
物种的遗传变异反映了该物种适应环境变化能力的强弱，遗传变异程度越高，说明群体的多样性越丰富，对环境变化的适应能力也就越强；而低的遗传多样性对物种的生存有着不利影响，增加了物种灭绝的风险。根据Grant等[10]对线粒体DNA序列遗传变异的分类，三个品种都具有高的单倍型多样度（Hd>0.500）和高的核苷酸多样性指数（Pi>0.00500），说明这些群体遗传变异较为丰富，可产生许多新的突变，有较强的适应能力、生长能力和进化潜力。李祥龙等[11，12]和金红等[13]利用RFLP方法分析表明中国蒙古羊、小尾寒羊等家养绵羊品种线粒体DNA多态性比较贫乏；而本研究获得的三个品种的mtDNA D-loop区核苷酸多样度（Pi） 分别为0.04664、0.03886和0.04891，这些值均高于被认为线粒体DNA多态程度较低的范围（0.00150～0.00470）[14]。本研究所得核苷酸多样度结果与利用测序法研究绵羊mtDNA D-loop区的研究结果基本一致[15-18]。另外，三个品种拥有较高的单倍型多样度（平均值为0.9253），与成述儒等[19]的研究结果一致。就小尾寒羊这个品种而言，本研究计算所得单倍型多样度和核苷酸多样性指数与黄庆华等[20]报告的结果相近。中性检验显示这三个品种都未经历过群体扩张或瓶颈。
在群体遗传学研究中，遗传分化指数值常用来表示群体间的遗传分化程度，数值越大表明群体间分化程度越显著，Fst值在0～0.05之间说明群体间的遗传分化很小，在0.05～0.15之间说明群体间存在中等程度的遗传分化，在0.15～0.25之间说明群体间的遗传分化较大，Fst值大于0.25说明群体间的遗传分化很大。本研究中三个品种的Fst值在0.3240～0.5909之间，远大于0.25，说明群体间遗传分化程度较高。
根据Nei估算，同一物种内的种群间遗传距离变动在0～0.05之间；亚种间的遗传距离约为0.02～0.20；种间遗传距离的变幅为0.10～2.00之间。从三个品种的遗传距离来看，鲁西黑头羊与杜泊羊之间的遗传距离为0.1187，达到了种间的遗传距离，与小尾寒羊之间的遗传距离为0.0654，达到了亚种间的水平，这可能是由于育种过程中采用小尾寒羊作为母本，而线粒体基因又是母系遗传造成的。鲁西黑头羊以杜泊羊与小尾寒羊通过杂交选育和扩繁育成，经过10多年的育种，继承了杜泊羊的高产肉性能和小尾寒羊的高繁殖性能，遗传上已经达到了品种的要求。
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