基于生物效价和整合溶出度的六味五灵片体外溶出度研究

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[摘要]为了探讨化学-生物联合评价六味五灵片体外溶出度的可行性，该实验考察在0.1%SDS溶出介质中，不同溶出时间的六味五灵片溶出液对LX-2肝星状细胞的抑制作用，提出基于细胞抑制率所得六味五灵片的累积溶出度，与HPLC所测的五味子甲素、特女贞苷、连翘苷各指标成分的溶出度及自定义权重系数的多成分整合的溶出度运用f2相似因子法分别进行相关性评价。结果显示，五味子甲素、连翘苷、特女贞苷各指标成分和整合溶出度与生物溶出度相比较，f2相似因子依次为61，43，61，75，说明多成分整合的溶出度能更全面地反映全方的生物效价，以生物活性为导向的多成分整合的溶出度评价方法有望成为评价六味五灵片体外溶出度的有效手段之一。

[关键词]整合溶出度；生物评价；六味五灵片；f2相似因子

六味五灵片（LWT）由五味子、女贞子、连翘、莪术、苣荬菜、灵芝孢子粉组成，可滋肾养肝，活血解毒，临床上常用于治疗慢性乙型肝炎[1]。近年来，大量的临床研究发现六味五灵片具有良好的抗肝纤维化作用[2-4]。但其活性效成分及作用机制尚不清楚，且现有质量标准仅把五味子甲素作为质量控制的指标成分，这种“惟成分论”的质量评价模式，仅能控制部分指标性成分的一致性和稳定性，难以完全、有效地评价药物的质量。

溶出度检测已成为评价制剂处方和生产工艺的重要手段，同时也是评价制剂活性成分生物利用度和药物质量的内在指标[5-6]。中药固体制剂的溶出度评价研究较少，通常是借鉴化学药质量控制模式对单个或少数指标成分的量进行分析测定[7]。由于中药复方固体制剂的药效是多成分协同作用的结果，单纯检测一种或几种指标成分的溶出度会导致与整体药效的偏差，不能完全衡量中药固体制剂的质量[8]。而生物效价检测方法能够快速反映药物临床活性，用于评价中药品质及药性的研究。所以，近年来又有相关文献采用生物效价-多成分整合的体外溶出度评价模式，如复方鳖甲软肝片[9]、冬虫夏草[10]等，这种评价模式能够更为全面的评价药物的质量。四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法是一种细菌活性检测方法，该方法除具有操作简单、工作量小、快速的优点外，还能降低成本，因此本试验采用MTT比色法联合多成分整合的体外溶出度评价模式对六味五灵片的质量进行评价。

1材料

BSA124S型精密电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；RC-6型溶出度测试仪（天津新天光技术开发有限公司）；XDS-1B型倒置生物显微镜（北京京瑞天下科技有限公司）；FormaSeriesⅡ水CO2培养箱（3110SeriesⅡ水套，ThermoFisher）；全波长酶标仪（MultiskanGO型，ThermoScientific）；LX-2肝星状细胞（北京协和细胞资源中心）；

LX-2肝星状细胞（北京协和细胞资源中心）；六味五灵片（山东世博金都药业有限公司，批号140510）；五味子甲素（批号0764-9603），连翘苷（批号110821-200508），特女贞苷对照品（批号112927-202003）均购自中国食品药品检定研究院；色谱甲醇（Oceanpak，瑞典），水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1HPLC定量方法的建立

2.1.1色谱条件色谱柱为AlltimaC18柱（4.6mm×250mm，5μm），室温（30℃），进样量10μL。五味子甲素：流动相甲醇-0.1%磷酸（75∶25），检测波长250nm，流速1.0mL・min-1；连翘苷：流动相乙腈-水（25∶75），检测波长277nm，流速1.0mL・min-1。特女贞苷：流动相甲醇-水（34∶66），检测波长224nm，流速0.8mL・min-1。

2.1.2对照品溶液的制备分别精密称取对照品五味子甲素、连翘苷、特女贞苷适量，置50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度线，即得质量浓度分别为188，816，200mg・L-1的对照品母液。再分别精密吸取上述储备液1mL于10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度线，摇匀，即得质量浓度分别为18.8，81.6，20mg・L-1的对照品储备液备用。

2.1.3供试品溶液的制备分别取六味五灵片6片，按照溶出度测定法（《中国药典》2010年版附录XC第二法）[11]，以脱气处理的0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）200mL为溶出介质，转速为100r・min-1，依法操作，30min时，取样2mL，立即用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液。

2.1.4阴性对照溶液的制备按处方中药材比例，取除五味子、连翘、女贞子外的其他药材，按其工艺制成不含五味子、连翘、女贞子的阴性制剂。再按2.1.3项下方法制备，即得阴性对照溶液。

2.1.5专属性考察分别将对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液按2.1.1项下方法进行测定，供试品溶液中五味子甲素、连翘苷、特女贞苷与其他组分色谱峰达到基线分离，且阴性对照溶液在与对照品相同保留时间处无色谱峰，因此可认为处方中其他药材与辅料对此3种成分的测定无干扰，色谱图见图1。

2.1.6线性关系考察精密吸取18.8mg・L-1的五味子甲素对照品储备液适量，用甲醇稀释得0.0376，1.504，3.008，6.016，7.52mg・L-1的系列对照品溶液，分别吸取上述溶液，按2.2.1项下色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行线性回归，得回归方程Y=43353X-5779.1，R2=0.9997，表明其在0.376～7.52mg・L-1线性关系良好。

精密吸取81.6mg・L-1的连翘苷对照品储备液适量，用甲醇稀释得0.1632，0.6528，1.3056，2.6112，3.264mg・L-1的系列对照品溶液，分别吸取上述溶液，按2.2.1项下色谱条件进行测定，以峰

面积积分值为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行线性回归，得回归方程Y=5692.2X-1033.6，R2=0.9991，表明其在0.1632～3.264mg・L-1线性关系良好。

精密吸取20mg・L-1的特女贞苷对照品储备液适量，用甲醇稀释得0.2，0.8，1.6，3.2，4mg・L-1的系列对照品溶液，分别吸取上述溶液，按2.2.1项下色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行线性回归，得回归方程Y=20309X-1818.4，R2=0.9995，表明其在0.2～4mg・L-1线性关系良好。

2.1.7精密度试验分别精密吸取18.8mg・L-1五味子甲素对照品溶液，81.6mg・L-1连翘苷对照品溶液，20mg・L-1特女贞苷对照品溶液，按2.1.1项下方法测定五味子甲素、连翘苷、特女贞苷的峰面积，在1d内连续进样6次，以考察日内精密度；每天进样1次，连续6d，以考察日间精密度。结果五味子甲素日内精密度RSD0.75%，日间精密度RSD1.2%；连翘苷日内精密度RSD0.94%，日间精密度RSD1.4%；特女贞苷日内精密度RSD0.98%，日间精密度RSD1.5%。

2.1.8稳定性试验取供试品溶液，分别于0，2，4，8，12h取样10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，结果显示，供试品溶液在12h内，五味子甲素峰面积的RSD1.4%，连翘苷峰面积的RSD1.6%，特女贞苷峰面积的RSD1.8%，表明供试品溶液在12h内稳定。

2.1.9重复性试验取六味五灵片，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，再按2.1.1项下方法测定五味子甲素、连翘苷、特女贞苷的峰面积，测定结果显示五味子甲素的RSD1.4%，连翘苷的RSD1.7%，特女贞苷的RSD1.9%，结果表明，该方法重复性良好。

2.1.10加样回收率试验先按2.1.1项下方法测定供试品中五味子甲素、连翘苷、特女贞苷的量；另量取已知质量浓度的供试品，共9份，加入相当于所取样品溶液标示量80%，100%，120%的五味子甲素、连翘苷、特女贞苷对照品溶液，依法测定，计算回收率。结果显示五味子甲素的平均回收率98.95%，RSD1.9%；连翘苷的平均回收率99.73%，RSD1.5%；特女贞苷的平均回收率99.65%，RSD1.6%，表明本法回收率较好，准确度较高。

2.1.11六味五灵片各成分的含量测定取3批六味五灵片各10片，研细，分别精密称取约0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定质量，超声提取30min，放冷，再称定，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm的微孔滤膜，再将其按2.1.1项下色谱条件进样测定，采用外标法计算五味子甲素、连翘苷、特女贞苷的含量。结果表明3批药品五味子甲素的平均含量为0.636mg/片，连翘苷为0.281mg/片，特女贞苷为0.176mg/片。

2.2溶出度的测定

取六味五灵片6片，按《中国药典》2010年版二部附录XC溶出度测定法第二法，以脱气处理的0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）200mL为溶出介质，转速为100r・min-1，依法操作，分别于5，10，15，20，30，60，90min时取样2mL（并同时补加等量同温溶出介质），0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液（样品1～7），取供试品溶液2mL冷冻干燥。按2.1.1项下方法测定样品溶出液峰面积，代入回归方程中，计算各时间点六味五灵片3种成分的平均累计溶出度，结果见表1。

累积溶出度=[ρn+（ρ1+ρ2+…+ρn+1）]V取/（ρ0V总）

式中ρn为第n个取样点的质量浓度，V总为溶出体积，V取为取样体积，ρ0为超声提取液质量浓度。

2.3基于生物效价的六味五灵片体外溶出度的测定

2.3.1相对累计溶出率的测定精密称取市售六味五灵片10片，研细后精密称取相当于平均1片质量（W），置于200mL量瓶中，加入已脱气处理的溶出介质200mL，超声处理50min后，取出，放冷，补加溶出介质至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过（即得样品8）。按2.1.1项下色谱条件，测定峰面积值（A），计算相对累计溶出率。

相对累积溶出率=（Ai×W）/（A×Wi）

2.3.2细胞抑制率的测定将复苏后的LX-2细胞以含体积分数20%胎牛血清、1×10U・L-1青霉素及100mg・L-1链霉素的DMEM培养液均匀接种于培养瓶，放置培养箱（37℃，5%CO2）连续培养传代。当细胞处于对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，培养液悬浮细胞。调整细胞密度至1×104个/mL后，接种于96孔培养板培养24h（每孔200μL）[12]，取1mL溶出液与1mL含5%胎牛血清的DMEM培养液混合制成样品，每孔加入200μL样品，待药物作用相应时间后，每孔加入5g・L-1的MTT液20μL，继续孵育4h，加入DMSO200μL，振荡20min后，使结晶物充分溶解。在波长490nm下，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度A，根据下列公式计算各个溶出液的细胞抑制率。

抑制率=（A0-A1）/A0

A1为溶出液的吸光度，A0为空白组的吸光度。

2.3.3基于肝星状细胞抑制率的六味五灵片体外溶出度基于常规化学分析，计算中药固体制剂平均累积溶出率的方法，运用细胞生长抑制率（K）提出肝星状细胞抑制率中药固体制剂的体外溶出度。实验结果见表2（K已经减除溶出介质的影响）。

溶出度=（Ki×W8）/（K8×Wi）

式中W8为六味五灵片单片片重，Wi为六味五灵片平均片重，Ki为各点溶出液的细胞抑制率的均值，K8为样品8细胞抑制率。

2.4自定义权重系数的六味五灵片溶出曲线整合模型的建立

根据六味五灵片中各成分在平均1片中的量（Ci）在3种成分总量（C）所占比值自定义为各成分在总量中的权重系数（εi）。将每一时间点下3种单体成分累积溶出度（C）赋以各自的权重系数，计算各成分的整合累积溶出率。六味五灵片各成分自定义权重系数及整合累积溶出率的计算按公式进行。

εi=Ci/（Cde+Cph+Cspe）

Ct=εde×Cde+εph×Cph+εspe×Cspe

de，ph，spe分别表示五味子甲素、连翘苷、特女贞苷3种成分，i分别代表3种成分，Ct表示各时间点的整合累积溶出率。

六味五灵片3种成分自定义εi分别为五味子甲素0.57，特女贞苷0.19，连翘苷0.24，不同时间点其溶出度的整合计算结果Ct分别为10.1%，27.5%，45.6%，58.2%，78.5%，94.3%，98.7%。整合溶出曲线与各成分溶出曲线比较见图2。

2.5f2相似因子法判断释放度曲线相似性

运用f2相似因子法分别将五味子甲素、连翘苷、特女贞苷和整合溶出曲线与生物溶出曲线比较，结果f2相似因子分别为61，43，61，75，结果表明整合溶出曲线与生物溶出曲线相似，基本能反映全方的生物效价。

3讨论

本试验预先考察了六味五灵片在4种溶出介质（水，pH7.4PBS，0.1%SDS，20%乙醇）条件下几种成分的溶出度，结果发现，在0.1%SDS中六味五灵片的溶出值最大，同时考虑到样品溶解性和细胞实验条件，选择小杯法且在0.1%SDS下测其溶出度。由试验结果发现，0.1%SDS对LX-2细胞有抑制作用，所以采用的是校正抑制率。

为了更全面的控制六味五灵片的质量，本试验参考符合中药多组分、多靶点整体用特征的多成分整合药动学[13]提出自定义权重系数的六味五灵片溶出曲线整合模型，将化学检测的成分溶出曲线进行整合，结果表明整合的溶出曲线能基本代表全方药效，而单一成分五味子甲素不能完全代表全方药效，同时，发现特女贞苷和五味子甲素与生物溶出曲线同样具有相似性，可以为实际应用增加六味五灵片的质量控制指标成分提供依据。

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