产凝集素乳杆菌的筛选及PCR-16SrDNA鉴定
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摘要：目的从泡菜汁中分离产凝集素乳杆菌并鉴定。方法通过凝集实验筛选产凝集素的乳杆菌，用聚合酶链式反应（PCR）扩增16S rDNA可变区基因鉴定产凝集素乳杆菌。结果此菌株呈革兰阳性，短杆状，产乳酸。通过同源性比较，此菌株与Lactobacillus plantarum strain p215的同源性为99 %。结论分离得到了产凝集素的菌株，鉴定表明此菌株为植物乳杆菌。
关键词：泡菜；乳杆菌；分离；鉴定；凝集活性；DNA；核糖体；序列分析
中图分类号：Q513+.2文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)09-0009-03
Screening of Lectin-producing Lactobacillus and Identification of its 16S rDNA Gene
XU Jin1, ZHAO Sheng-lan2, CHEN Chao-yin1*
(1. Institute of Bioresource R&D of Kunming University of Science and Technology-Tsinghua University, Kunming 650224, China; 2. Department of Applied Pharmacy, Yunnan Institute of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650220, China)
Abstract：Objective To isolate and identify lectin-producing lactobacillus from sauerkraut juice. Methods The lectin-producing lactobacillus was isolated by hemagglutination assay and identified by polymerase chain reaction (PCR) amplification of variable regions of the 16S rDNA gene. Results This strain was gram-positive, short bacilliform and lactic acid-producing. The homology to Lactobacillus plantarum strain p215 was 99 %. Conclusion The lectin-producing lactobacillus is obtained and identified as Lactobacillus plantarum.
Key words：sauerkraut; lactobacillus; isolation; identification; agglutinating activity; DNA; ribosome; sequence analysis
凝集素是一类由动植物细胞分泌的糖蛋白，在细胞识别及黏着反应中起重要作用。近年，凝集素的研究取得了重大进展，其家族成员不断增加，同时发现了凝集素的更多功能，如促有丝分裂，细胞识别，病毒的毒力决定子，凝集恶性细胞、、骨髓细胞等。由于凝集素具有高度的糖结合专一性，已成为研究生物学和临床学非常有用的工具，用于分离纯化和确定糖复合体、细胞分裂、鉴定微生物、肿瘤诊断、治疗及预防骨髓移植等[1，2]。研究还表明，某些凝集素具有抗HIV活性[3，4]。鉴于目前还未见植物乳杆菌产凝集素抗HIV的报道，因此我们以泡菜为研究对象，分离鉴定乳杆菌及筛选出产凝集素的乳杆菌，对深入研究凝集素的抗HIV功能具有重要意义。
目前，微生物可以通过基因的相似性分类，从而反映其在进化过程中的地位。在生物进化的漫长过程中，rRNA/rDNA分子保持相对恒定的生物学功能和保守的碱基排列顺序，在结构上可分为保守区（conserved domain）和可变区（variable domain）。l6S rRNA/rDNA序列分析方法就是利用16S rRNA/rDNA保守区序列特别保守的特点，设计引物扩增16S rRNA/rDN段，利用可变区序列的差异对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定[5]。
1材料与方法
1.1材料
泡菜样品（市售）；MRS培养基（参照文献[6]配制）。
1.2乳杆菌的分离鉴定
1.2.1泡菜汁样品中乳杆菌的分离过滤市售泡菜汁样品，将滤液稀释为100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-67个梯度。在无菌工作台上分别吸取0.2 mL7个浓度梯度的样品置于无菌MRS固体分离平板上，涂布均匀，每一梯度样品涂布3块平板，静置20 min，倒置。将培养板置于干燥器内，里面点燃蜡烛，盖上盖子，直至烛火熄灭。将置有培养板的干燥器放入37 ℃隔水式电热恒温培养箱36 h后，取出培养板，观察平板上菌落生长情况，周围有透明圈的菌落初步定为乳杆菌菌落。
1.2.2乳杆菌的革兰染色参照文献[7]进行。
1.2.3乳杆菌产乳酸的纸层析鉴定参照文献[7]进行。
1.2.4透射电镜观察分离所得的乳杆菌细胞用接种环挑取MRS固体平板上培养的菌体至50 μL eppendorf管内，加入少许蒸馏水，制成浓的菌悬液。吸一滴菌悬液置平放的一次性防菌塑料手套上，夹取100目专用铜网片置菌悬液液滴上，使铜网片吸附菌悬液片刻。夹起铜网片，用滤纸吸去铜网片上未吸附的菌悬液。将铜网片置于磷钨酸（PTA）染液液滴上，染色90 s后，夹起铜网片，滤纸吸去多余染液，用透射电镜观察制备好的铜网片。
1.3分离乳杆菌的16S rDNA序列的测定与进化地位的鉴定
1.3.116S rDNA序列的测定PCR引物采用16S rDNA保守基因的通用引物27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTAG-3'，1492R: 5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'进行PCR扩增（引物由上海生工生物工程技术有限公司合成）。
基因组DNA的提取：取乳杆菌单菌落接10 mL MRS液体培养基，37 ℃培养24 h后取2 mL菌液离心去上清，用酚/氯仿抽提法[8,9]提取基因组DNA。PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸10 min，30个循环。取4 μL PCR产物用1 % Agrose电泳检测[10]。PCR产物由上海生工生物工程技术有限公司测序。
1.3.2乳杆菌的分类地位鉴定将测得的全序列先以BLASTn软件在GenBank上进行相似性检索，找出同源性最接近的菌株，继而确定该菌株的分类地位。
1.4血凝实验
用96孔U形血凝板，每排12孔均加入25μL TBS缓冲液，然后向每排的第2孔加入25μL样品，梯度稀释（即将第2孔的样品与缓冲液混匀后，吸出25μL加入第3孔，混匀后同样吸出25μL加入第4孔，依次稀释样品）。每排从第3孔开始，样品的浓度按2-x（x=1，2，…，10）规律递减。然后向血凝板各孔加入25μL红细胞悬液，轻微振荡，将血凝板置于室温或37 ℃培养箱中1～2 h，肉眼观察凝集效果。
2结果
2.1乳杆菌菌落形态
培养分离到的乳杆菌，观察平板上的菌落形态，见图1。
乳杆菌菌落呈现乳白色，多为圆形凸起，菌落表面湿润黏稠，边缘光滑，直径3～4 mm。
2.2乳杆菌的革兰染色结果
对分离到的乳杆菌进行革兰染色，然后置于光学显微镜下观察，细胞形状见图2。
乳杆菌经革兰染色后呈蓝紫色，即为革兰阳性，细胞为短杆状。
2.3乳杆菌细胞的透射电镜观察结果
透射电镜下观察乳杆菌细胞，其形态见图3。细胞呈短杆状，约长1μm，宽0.5μm，无鞭毛。
2.4乳杆菌16S rDNA的序列测定及地位鉴定结果
测定了乳杆菌16S rDNA的序列，比对该序列与NCBI提交的Lactobacillus 属菌株的16S rRNA序列，表明分离出的乳杆菌与Lactobacillus plantarum strain p215有99 %的同源性。由此推断从泡菜汁分离到的乳杆菌菌株乳杆菌属于Lactobacillus plan-tarum，即L.plantarum 乳杆菌。
2.5L.plantarum 乳杆菌产凝集素样物质的血凝实验结果
按照血凝实验方法，将L.plantarum 乳杆菌发酵液离心后的上清与菌体破碎后的离心上清以及空白MRS培养液对兔红细胞进行凝集实验，结果见图4。
注：1排，空白MRS培养液；2排，菌体破碎上清液；3～6排，发酵液的离心上清液；1，2列，空白对照
由图4可见，空白MRS培养液和L.plantarum 乳杆菌菌体破碎后的离心上清均无凝集活性，即它们不含凝集素样物质；L.plantarum 乳杆菌发酵液的离心上清液具有凝集活性，证明该样品中含有凝集素类物质。
3讨论
本研究从市售泡菜汁液中分离出1株乳酸杆菌乳杆菌。对乳杆菌进行了形态学鉴定，呈短杆状，约长1μm，宽0.5μm，无鞭毛，革兰阳性，产乳酸。
文献报道可用16S rDNA可变区的基因序列分析鉴定乳酸菌[11,12]。本研究通过PCR扩增16S rDNA高度保守区域的基因序列（包含可变区基因序列），此序列正是鉴定乳杆菌的基因序列。根据Matsuki的研究，凡是16S rDNA可变区序列的同源性大于97 ％，便可认为是同一属种[13,14]。根据乳杆菌16S rDNA序列的一段保守区序列设计了1对通用引物，对其可变区序列进行扩增，并将扩增产物的核苷酸序列与GenBank上的标准序列进行比对，表明它与Lactobacillus plantarum strain p215的同源性达到99 %。本研究结果表明，本方法简便、快速，用于鉴定来源于泡菜的未知乳杆菌成本低。本研究通过兔红细胞的血凝实验，证实L.plantarum菌体破碎后的离心上清液没有凝集活性，但其发酵液中含有凝集素样物质，表明该菌株产生凝集素，并且分泌到胞外。因此，该菌株具有进一步研究的价值，并为深入研究L.plantarum所产凝集素的抗HIV功能奠定了基础。
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