益气活血化瘀法对肝癌前病变大鼠TGFβ―1、Smad4影响的实验研究

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【摘 要】目的：探讨益气活血化瘀法对大鼠肝癌前病变TGF-β1、Smad4的影响。方法：80只雄性Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、中药高剂量组、中药低剂量组，用二乙基亚硝胺诱导肝癌的发生发展，以益气活血化瘀法对肝癌大鼠进行ELISA法tgf-β1、smad4统一测定；另常规取材按电子和光学显微镜观察固定，并观察其病理组织学变化。结果：与模型组相比，中药高、低剂量组在4、12、20周时TGF-β1、Smad4明显上调。结论：TGF-β1、Smad4与肝癌的发生密切相关，益气活血化瘀法通过促进肝脏组织TGF-β1、Smad4的表达，从而对减缓大鼠肝癌的形成有一定作用，同时，益气活血化瘀法对肝癌前病变肝脏组织亦有明显改善作用。

【关键词】益气活血化瘀法；肝癌前病变；TGF-β1；Smad4

肝癌细胞的凋亡在肝癌发生发展过程中起重要作用，而TGF-β1、Smad4蛋白酶在肝癌凋亡信号传导中起重要的作用，研究表明TGF-β1、Smad4蛋白酶的激活与肝癌细胞凋亡有密切联系[1-2]。因此，在肝癌的预防及治疗工作中研究TGF-β1、Smad4是十分有必要的。我们综合前期的研究成果认为益气活血化瘀法对肝癌前病变细胞有显著的防治作用，为了探讨该法在肝癌细胞和肝癌相关疾病过程中的作用机理，我们应用二乙基亚硝胺（DEN）方法诱导大鼠肝癌细胞模型，进一步观察该法在肝癌促癌过程中对Smad4、TGF-β1的变化及影响。

1 材料与方法

1.1 药物：中药组成：黄芪、炒白术、丹参、川芎、当归、石见穿、地虫，分别配制成含有生药浓度0.5g/ml 、1.0g/ml的两种中药制剂.

1.2 动物：清洁级雄性Wistar大鼠共80只，大鼠体重80克～100克，大鼠由长春高新医学动物研究中心提供.实验动物大随机分空白组、模型组、中药低剂量组和中药高剂量组4组。

1.3试剂与设备：TGF-β1、Smad4试剂盒购买于南京建成试剂有限责任公司；二乙基亚硝胺由Sigma公司生产；加样枪德国生产；德国离心机CR21型；日本MDF-V50V型超低温冰箱；玻璃匀浆器；分光光度仪，美国生产。

1.4 实验方法：在第1周将正常组大鼠腹腔注射生理盐水100mg/kg，将模型组、中药组大鼠腹腔注射DEN造模，剂量为100mg/kg.从第2周开始，中药组大鼠和模型组大鼠按每周70mg/kg DEN的水溶液剂量，连续灌胃20周.造模成功后，中药低剂量组给予每日生药含量0.5g/ml的中药汤剂按10ml/kg灌胃，每日进行1次；中药高剂量组按1.0g/m标准进行，每日1次；正常组和模型组大鼠给予10ml/kg生理盐水每日1次灌胃，共20周.4组分别于喂养第4、第12、第20周时，各组分别取5只大鼠杀死后取肝脏组织，第20周时将其余大鼠全部杀死后剖取肝脏.并在肝脏左叶的取相同的部位取材，除去血液后拭干，并按2g：2ml的比例加如入冰盐水，用玻璃匀浆器在冰浴中制作成匀浆.在离心机离心20分钟后取离心上清液封存，置于低温冰箱保存备用.

1.5 统计分析：各组数据以（均数±标准差）表示，应用SPSS15.0统计软件计学处理.检验方法用方差分析，组间的比较采用LSD法检验和q（SNK法）

2 结果

3 电镜下病理改变

正常组：细胞多成圆形或核圆，可见1至2个核仁，在肝脏细胞浆内见有线粒体、糖原颗粒结构、粗面内质网结构.

模型组：可见细胞排列紊乱，肝脏细胞核形不规整，线粒体、滑面内质网增多，大部分线粒体嵴显示不清，粗面内质网明显扩张，出现次级溶酶体增多.

中药低剂量组：可见镜下肝脏细胞排列不规则，细胞膜不规整，肝细胞核缩小，细胞核形态不规整，见少量线粒体膜性结构融合，粗面内质网结构可见轻度扩张，肝脏胞浆内见少量次级溶酶体.

中药高剂量组：可见镜下肝脏细胞排列不规整，肝脏核膜有皱缩，线粒体大小形态未见明显改变，线粒体嵴显示欠清，滑面内质网少部分增生.

4 光镜下病理改变

空白组：各个时期的大鼠肝脏细胞形态基本正常，细胞排列基本完整，肝小梁、肝血窦排列基本正常。

模型组：4周时出现部分肝脏细胞变性、坏死、甚至空泡样改变；12周时，肝脏细胞纤维化出现。肝脏局限性增生结节形成，数量逐渐增多。部分肝脏出现核异质变性；20周时，增生结节呈逐渐增大，结节内肝脏细胞异型性出现，部分表现为核异质变性，异性细胞结发展，癌变细胞于结节中出现。

低剂量组：4周时，未见细胞空泡样变性；12周时，异常增生节形成，部分纤维化改变出现。20周时，病变相当于模型组第12周的改变，未见明显的肝脏癌变细胞。

高剂量组：第4周时，与低剂量组基本相同；12周时，肝脏细胞异常增生结节明显形成，少部分大鼠出现部分纤维化改变，但程度较轻。20周时，肝细胞改变与模型组第12周相近，但程度仍较轻。

5 讨论

研究发现，Smad4为TGF-β1信号传递蛋白，两者在恶性肿瘤中的表达密切相关，Smad4是TGF-β1的信号从胞质传导到细胞核内的中介分子，在TGF-β1诱导基因表达调控和随后的生长抑制中是必不可少的关键转录因子[3]。TGFβ1/Smads信号转导通路的改变在许多肿瘤的发生和发展中起着非常重要的作用，TGFβ1/Smads信号转导通路通过调节基因转录，使细胞生长抑制、分化或凋亡，这一通路中的任一环节异常都会导致细胞生长分化失去控制。

实验结果表示，益气活血化瘀法在大鼠肝癌的形成过程中能明显上调肝脏TGF-β1的表达水平和下调肝脏Smad4的表达水平，对TGF-β1、Smad4的作用具有一定的剂量依赖性。因此我们分析，益气活血化瘀法可能通过上调TGF-β1和下调Smad4水平来抑制大鼠肝癌细胞的形成水平来抑制大鼠肝癌的形成。通过光镜、电镜组织病理改变，提示益气活血化瘀法对肝癌前病变组织有明显的修复作用。

参考文献：

[1] He Y，Yang F，Wang F，et al. The upregulation of expressedproteins in HepG2 cells transfected by the recombinant plas-mid-containing HBx gene[J]. Scand J Immunol， 2007， 65（3）：249-256.

[2] Migita K， Miyazoe S， Maeda Y， et al. Cytokine gene poly-morphisms in Japanese patients with hepatitis B virus infec-tion--association between TGF-beta1 polymorphisms and hep-atocellular carcinoma[J]. J Hepatol，2005， 42（4）： 505-510.

[3] Migita K， Miyazoe S， Maeda Y， et al. Cytokine gene poly-morphisms in Japanese patients with hepatitis B virus infec-tion--association between TGF-beta1 polymorphisms and hep-atocellular carcinoma[J]. J Hepatol，2005， 42（4）： 505-510.

[4] Hesling C，Fattet L，Teyre G，Jury D，Gonzalo P，LopezJ，Vanbelle C，Morel AP，Gillet G，Mikae-lian I，Rimokh R.Antagonistic regulation of EMT by TIF1 and Smad4 in mammary epithelial cells.EMBO Rep 2011；12：665-672