洋葱Ms位点多重PCR标记的开发与优化

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摘要：以本课题组已获得的洋葱ms位点侧翼序列为基础，设计、筛选引物获得了一个兼容的多重pcr分子标记，并对其反应体系和反应程序进行了优化。优化后的扩增体系：10×PCR buffer （Mg2+ free） 2.5 μL、25 mmol/L MgCl2 4 μL、2.5 mmol/L dNTP 6 μL、DNA模板1 μL （约50 ng）、10 μmol/L引物各1 μL、5 U/μL rTaq聚合酶0.6 μL、用灭菌双蒸水补齐至25 μL；反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，65.4℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。优化后的体系和程序可以检测到清晰的目的条带，通过一次PCR反应即可鉴定Ms位点的3种基因型（MsMs、Msms、msms），操作简单，稳定性好。

关键词：洋葱；雄性不育；Ms位点；多重PCR标记

中图分类号：S633.203.6文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）09-0007-05

洋葱（Allium cepa L.）为两年生二倍体（2n=2x=16）蔬菜植物，广泛种植于世界各地。于近代传入我国，适应性强，耐贮藏和运输，具有广泛的生物活性和重要的药用价值[1]，发展迅速。

洋葱是世界上最早利用雄性不育选育杂交种的蔬菜作物之一，其雄性不育根据细胞质的类型可分为S型和T型。在S型雄性不育系统中，不育性是由单个核基因和细胞质基因共同控制，并且不育性状可被显性核基因（Ms）恢复。在洋葱细胞质育性鉴定上，国内外多个研究团队已成功开发出了几种鉴定细胞质类型的分子标记[2～6]，这些分子标记能够使育种者在几小时内鉴定洋葱细胞质的类型，不需要进行4～8年的测交验证。在洋葱育性恢复基因研究上，由于洋葱基因组DNA巨大（17.9 pg，15 290 Mbp/C）[7]，是玉米基因组的6倍、番茄的16倍、拟南芥的107倍[8]，国内外研究进展缓慢，所开发的分子标记均具有各自的优缺点[9～12]，很难应用于多样性遗传背景亲本材料基因型的鉴定，也无法满足育种过程高通量筛选的需要。

山东省农业科学院蔬菜花卉研究所葱姜蒜研究中心于2013年开发了两个分别与显性Ms和隐性ms等位基因共分离的SCAR标记，分别为DNF-566和RNS-357[13]。这两个标记已通过2个BC1群体、29个育种系和7个杂交种的验证，所鉴定的基因型与表型完全一致。但这两个标记需要两次PCR检测，才可确定Ms位点的基因型。

本试验在前期研究的基础上[13]，拟筛选出洋葱Ms位点兼容的多重PCR分子标记，然后进行扩增体系和程序的优化，开发通过一次PCR试验即可鉴定洋葱Ms位点基因型（MsMs、Msms、msms）的PCR检测系统，进而用于洋葱雄性不育系及保持系的选育，加速洋葱育种系及杂交种选育进程，提高选育效率。

1材料与方法

1.1供试材料

洋葱新鲜叶片采自山东省农业科学院蔬菜花卉研究所试验基地，取样后迅速放入液氮中冷冻，于-80℃保存备用。验证标记所用群体为回交群体[118 ×（118×12-12）]，118为雄性不育系，12-12为对应恢复系。

1.2基因组总DNA的提取

洋葱基因组总DNA的提取采用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒（天根生物，北京），方法参照操作说明书。

1.3引物设计

本研究所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。UM1、DM1、UM2、DM2为根据Ms侧翼序列设计的引物，Um1、Dm1、Um2、Dm2为根据ms侧翼序列设计的引物（表1）。设计引物时确保引物的3′端为多态性位点。

1.4引物组合

显性Ms位点侧翼序列2对引物（UM1、DM1和UM2、DM2）与隐性ms位点侧翼序列2对引物（Um1、Dm1和Um2、Dm2）分别组合（表2），先在标准体系下对MsMs、Msms、msms 3种基因型单株进行PCR扩增，选择能扩增出目的单倍型的引物组合进行反应体系的优化。

1.5试验设计

1.5.1标准的PCR体系及程序PCR反应总体积为25 μL，其中基因组DNA 1 μL（约50 ng），10×PCR buffer（Mg2+ free）2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 1.5 μL（终浓度为1.5 mmol/L），2.5 mmol/L dNTP 3 μL（终浓度为0.3 mmol/L），4条10 μmol/L引物均为1 μL（终浓度为0.4 μmol/L），5 U/μL rTaq 0.2 μL（终用量为1 U），用灭菌双蒸水补齐至25 μL。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃保温10 min，4℃保存。PCR扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像系统上拍照记录。

1.5.2多重PCR反应体系及程序的优化在标准反应体系及程序的基础上，先后对Mg2+浓度、dNTP浓度及冻融次数、最佳退火温度、DNA聚合酶及模板DNA的用量进行了优化。

2结果与分析

2.1不同引物组合的筛选

两对显性Ms等位基因特异性引物与两对隐性ms等位基因特异性引物分别组合，共获得4个组合（表2）。4个引物组合在标准体系下，扩增MsMs、Msms、msms 3种基因型的洋葱，结果（图1）表明，只有引物UM2、DM2与Um2、Dm2的组合（即多重PCR标记MK4）在3种不同基因型材料中都扩增出了特征带（Ms：905 bp，ms：661 bp），MK1和MK2几乎没有Ms的特征条带，MK3在Msms基因型材料中Ms特征条带扩增效率低。因此，选择MK4进行PCR反应体系的优化。