响应面法优化泽泻中23―乙酰泽泻醇B闪式提取工艺

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[摘要]采用响应面分析法优化得到23-乙酰泽泻醇B闪式提取的最佳工艺。采用单因素考察法，以23-乙酰泽泻醇B提取率为指标，考察乙醇浓度、液料比、提取次数、提取时间对23-乙酰泽泻醇B提取率的影响，并结合Box-Behnken试验设计和响应面分析方法对闪式提取泽泻的工艺参数进行优化，得到23-乙酰泽泻醇B闪式提取最佳工艺为80%乙醇、液料比12∶1、提取4次、提取时间114 s/次。通过响应面法优化得到的23-乙酰泽泻醇B闪式提取工艺，稳定、省时、高效，且具有可室温提取、无成分破坏的优点，可用于实际大生产。

[关键词]23-乙酰泽泻醇B；闪式提取；响应面法

[Abstract]Response surface methodology was used to optimize and obtain the optimal flash-type extraction technology of alisol B 23-acetate from Alismatis Rhizoma.With the extraction rate of alisol B 23-acetate as an indicator， single-factor test was used to investigate the effect of ethanol volume fraction， liquid-solid ratio， extraction times and extracting time on the extraction rate of alisol B 23-acetate.The results were combined with Box-Benhnken design and response surface analysis to optimize the technology parameters for extraction process of Alismatis Rhizoma and obtain the optimal flash-type extraction technology under the following conditions： ethanol volume fraction 80%， liquid-solid ratio 12∶1， extraction 4 times， 114 s/time. Flash-type extraction technology of alisol B 23-acetate by response surface methodology is stable， time-saving， efficient， and with the advantages of room temperature extraction and no component damage， so it can be used for massive production.

[Key words]alisol B 23-acetate； flash-type extraction； response surface methodology

闪式提取法是以组织破碎原理为基础，结合剪切、真空、渗透、流体动力等原理。通过破碎使充分暴露的被提取成分在负压、剪切、高速碰撞等各种外力作用下被溶剂分子包围、解离、溶解、替代、脱离，然后迅速进入溶剂中，瞬间达到溶剂浓度的平衡，实现了技术间组合相承，从而达到快速提取的目的。该技术提取速度快，可有效减少有效成分的变性或失去活性的损耗，故该技术值得广泛应用[1]。

泽泻是临床常用的中药，具有治疗小便不利，水肿胀满，泄泻尿少，痰饮眩晕，热淋湿痛，高血脂等病症；现代药理研究表明其具有抑制动脉粥样硬化、降血脂、利尿、降血压、抗脂肪肝等作用[2-3]。23-乙酰泽泻醇B是泽泻中的主要有效成分，具有利尿、抗炎[4]、降血脂、诱导多种肿瘤细胞凋亡的作用。对中枢神经系统、免疫调节系统、血液系统都具有一定的影响[5]。由于泽泻的药用部位是干燥块茎，质地坚实，传统的提取方法很难将有效成分提取完全，故本文采用闪式提取法对泽泻进行提取，且采用Box-Behnken法进行试验设计并通过响应面分析法对23-乙酰泽泻醇B提取工艺进行优化，以确定最佳提取条件，为泽泻开发利用提供参考[6]。

1材料

戴安U3000型高效液相色谱仪，美国戴安（DIONEX）公司，Waters Symmerty C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），JHBE-100A闪式提取器（河南金鼎科技发展有限公司）。

乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；纯化水（自制）；23-乙酰泽泻醇B对照品（批号111846-201203，中国食品药品检定研究院）；泽泻（批号130526，产地福建，经康缘大药房吴舟药师鉴定）。

2方法与结果

2.123-乙酰泽泻醇B定量测定方法的建立[7-10]

2.1.1色谱条件采用戴安U3000型高效液相色谱仪，Waters Symmerty C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相为乙腈-水（73∶27），检测波长为208 nm，柱温为25 ℃，流速为1.0 mL・min-1，理论板数按23-乙酰泽泻醇B峰计算应不低于3 000。

2.1.2对照品溶液的制备精密称取置五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的23-乙酰泽泻醇B对照品12.15 mg，加乙腈制成每1 mL含243 μg的溶液，即得。

2.1.3供试品溶液制备取本品粉末（过5号筛）0.502 3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙腈25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，乙腈补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4线性关系考察分别精密吸取对照品溶液0.1，0.5，1，4，8，10，12，20 μL进样。按上述色谱条件进样测定，以色谱峰面积（Y）对进样量μg（X）进行线性回归，绘制标准曲线，得回归方程为Y=2 000 000X-50 488，r=0.999 5；结果表明进样量在0.024 3～4.86 μg与峰面积线性关系良好。

2.1.5精密度考察精密吸取上述对照品溶液，在上述色谱条件下，连续进样6次，测定23-乙酰泽泻醇B峰面积积分值的RSD 1.1%，表明精密度良好。

2.1.6重复性考察取同一批中间体约0.50 g，按2.1.3项平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，计算23-乙酰泽泻醇B含量，RSD 1.2%，表明本测定方法重复性良好。

2.1.7稳定性考察取同一批中间体约0.50 g，按2.1.3项制备成供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h进样测定，测定23-乙酰泽泻醇B峰面积积分值的RSD 0.98%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.8加样回收率考察精密称取已知含量的同一批中间体，按称取样品中23-乙酰泽泻醇B含量精确加入已知含量的对照品，按2.1.3项下方法制备并测定其含量，平均回收率98.47%，RSD 0.91%，结果见表1。

2.223-乙酰泽泻醇B提取工艺的优化[11-12]

2.2.1单因素试验精密称取泽泻适量，分别加入不同浓度乙醇，闪式提取一定时间，过滤，取上清液，浓缩，得浸膏，以23-乙酰泽泻醇B为指标，选取乙醇浓度、液料比、提取次数、提取时间进行单因素试验。

2.2.2响应面分析优化提取工艺条件综合单因素试验结果，选取对23-乙酰泽泻醇B提取率影响较大的乙醇浓度、液料比、提取时间、提取次数4个因素，利用响应面分析法对工艺参数进行优化。通过Design Expert软件，对提取工艺进行响应面分析，根据数学模型，得到最佳工艺参数，分析因素与水平设计见表2。

3结果与讨论

3.1单因素试验

3.1.1乙醇浓度对23-乙酰泽泻醇B提取率的影响固定闪式提取时间100 s，液料比15∶1，提取次数2次，考察50%，60%，70%，80%，90%乙醇对23-乙酰泽泻醇B提取率的影响，见图1。23-乙酰泽泻醇B得率随乙醇浓度的升高而增加，80%乙醇时，23-乙酰泽泻醇B得率最高。23-乙酰泽泻醇B随乙醇浓度的提高，溶解度相应增大，得率随之提高。因此，中心组合试验选取70%～90%乙醇。

3.1.2液料比对23-乙酰泽泻醇B提取率的影响固定80%乙醇、闪式提取时间100 s、提取次数为2次，考察液料比为5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1对23-乙酰泽泻醇B的提取率的影响，见图2。当液料比由5∶1增加至15∶1时，23-乙酰泽泻醇B得率随之增加，并达到最大值，继续增加液料比，23-乙酰泽泻醇B得率几乎不变。液料比的增加加速了溶媒的传质过程，有助于23-乙酰泽泻醇B的溶出。因此中心组合试验选择液料比5∶1～15∶1。

3.1.3提取时间对23-乙酰泽泻醇B提取率的影响固定80%乙醇、液料比15∶1、提取次数为2次，考察闪式提取时间为30，60，100，120，140，180 s时对23-乙酰泽泻醇B的提取率的影响，见图3。当提取时间达到100 s时，23-乙酰泽泻醇B的得率最高，再延长提取时间，容易引起部分内酯键的破坏，从而导致23-乙酰泽泻醇B得率的下降。因此，中心组合试验选择提取时间60～140 s。

3.1.4提取次数对23-乙酰泽泻醇B提取率的影响固定80%乙醇、液料比15∶1、提取时间100 s，考察闪式提取次数为1，2，3，4，5次时对23-乙酰泽泻醇B的提取率的影响，见图4。当提取次数为4次时，23-乙酰泽泻醇B的得率已达到最高，再增加提取次数，23-乙酰泽泻醇B得率几乎不变。因此，中心组合试验选择提取次数为2～4次。

3.2工艺条件优化的响应面分析试验

根据Box-Behnken设计进行试验，采用响应面法对主要影响参数进行优化，采用Design-Expert 7.1.3统计软件进行试验设计与回归分析，见表3，回归分析结果见表4。

3.2.1模型拟合以及效应面图采用Design Expert软件，对表3中的数据进行多元回归拟合，选择对响应值显著的各项，可得乙醇浓度、液料比、提取时间以及提取次数、与23-乙酰泽泻醇B的二次多项回归方程，回归方程为泽泻醇提取率=86.31+3.75A+3.80B+3.93C+9.99D-0.47AB+1.92AC+1.50AD-1.76BC-6.87BD+0.35CD-7.89A2-17.65B2-7.38C2-6.88D2，回归方程高度显著，相关系数R2=0.992 3。故回归方程可较好地描述各因数与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定4个参数的最佳水平。模型预测泽泻醇的最高提取率为89.42%。由分析结果可算出各因素的最佳取值：79.28%乙醇，液料比为11.8∶1，提取时间为114 s，提取次数为3.8次。根据实际生产现状，将以上参数进行优化，最终得到的闪式提取泽泻的工艺为采用80%乙醇，按照12∶1的料液比进行投料，提取时间为114 s，提取次数为4次，效应面图见图5。

3.2.2优化工艺的验证为了验证优化工艺的稳定性，并与传统的醇提工艺进行比较，结果表明采用闪式提取法进行泽泻的提取，能够有效地缩短泽泻的提取时间，并且保证较高的泽泻醇提取率，可以将该方式向生产推广使用，相关数据见表5。

4结论

为了综合评价23-乙酰泽泻醇B的闪式提取率，在单因素试验的基础上采用Box-Behnken实验设计方法进行响应面设计，建立了23-乙酰泽泻醇B含量与各因素的回归方程，并得到以23-乙酰泽泻醇B含量为响应值的响应面图和等高线图，通过对试验结果的分析比较，确定最佳提取工艺条件为加12倍量80%乙醇，提取114 s/次，提取4次，在此条件下23-乙酰泽泻醇的提取率可达90%，表明闪式提取法是一种可以应用于泽泻中有效成分23-乙酰泽泻醇B的提取方法。闪式提取法是利用高速机械剪刀力和搅拌力，迅速破坏植物细胞组织，使组织细胞内部的成分快速溶解，该方法具有省时、高效、简单易操作，可室温提取、无成分破坏等优点，具有良好的应用前景。

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