化学萃取的异种神经修复神经缺损的可行性研究

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作者：刘品端，王伟，智晓东，梅晰凡

【摘要】

目的 探讨联合应用十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，sds）和脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate）的化学萃取方法，对异种神经移植段进行脱细胞处理，构建异种神经去细胞基质膜管，应用于修复周围神经缺损的可行性。方法 取新鲜兔坐骨神经，切成长10mm的神经段，用十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，sds）和脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate）反复处理新鲜的兔神经段构建成异种神经去细胞基质膜管,修复大鼠坐骨神经缺损。结果 4 个月后异种神经基质膜管与大鼠坐骨神经缝合处愈合良好，未见有神经瘤及粘连，he染色显示异种神经基质膜管组桥接处再生神经结构连续性良好,移植段可见神经纤维及新生的血管。s-100免疫组织化学染色可见阳性的雪旺氏细胞沿神经纤维分布成条带状。电镜超微结构观察可见再生的神经纤维较粗大，排列紧密，呈均匀一致圆型或椭圆型，髓鞘较厚，轴突结构完整。 结论 联合应用十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，sds）和脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate）的化学萃取方法构建的异种神经去细胞基质膜管可以修复大鼠坐骨神经缺损。

【关键词】 异种神经 去细胞基质膜管 化学萃取 坐骨神经 大鼠

abstract: objective to explore the feasibility of using the xenogeneic acellular nerve scaffold dealt with through new chemical extractive method which used sodium dodecyl sulfate (sds) and sodium deoxycholate to restore the peripheral nerve defect. methodsfresh sciatic nerve of rabbit was treated with a solution of sds and a solution of sodium deoxycholate，which was used to restore the peripheral nerve defect. results four months after operation, the anastomosis of the xenogeneic acellular nerve scaffold was smooth, and there were no neuroma, conglutination, inflammation and immune reaction. he staining showed that there were a lot of new born fibers and regenerated myelinated nerve fibers in the xenogeneic acellular nerve under light microscopy. positive schwann cells with s-100 immune staining showed a strip-shaped distribution along the regenerated nerve fibers. the structure of axon was completed, and the arrangement of regenerated nerve fibers with rotund or elliptoid shapes was closed. conclusions the xenogeneic acellular nerve dealt with through new chemical extractive method which used sodium dodecyl sulfate (sds) and sodium deoxycholate can be applied in the restoration of peripheral nerve defect.

key words：xenogeneic nerve; acellular nerve scaffold; chemic extraction; sciatic nerve; rat

周围神经缺损是临床上常见的损伤性疾病，当神经纤维断裂长度超过10 mm后，缺损的神经多半不能自发修复［1］，目前临床上对于长段神经缺损主要靠自体神经移植来修复，即取相对次要功能的自体感觉神经来修复主要功能的神经干，目前这种修复方式被公认为是治疗神经缺损的“金标准”。但自体神经移植这种“拆东墙补西墙”的方式存在着取材来源有限、供区功能丧失、形成神经瘤等问题［2］，限制了其临床应用。而异体神经的移植因排斥反应问题在临床上难以实现。近年人们对周围神经的再生有了新的认识——通过构建神经再生室，提供特定的微环境，阻止瘢痕组织长入神经断段，可以修复缺损的神经。

本实验利用十二烷基硫酸钠（sds），脱氧胆酸钠作为阴离子型去污剂可以破坏细胞膜并溶解其中的蛋白成份的特性，联合应用十二烷基硫酸钠（sds），脱氧胆酸钠反复处理新鲜的兔坐骨神经移植段，去除异种神经移植段中引起排斥反应的神经轴突和髓鞘等细胞成分，构建成异种神经去细胞基质膜管来修复大鼠坐骨神经缺损，通过检测术后大鼠坐骨神经的功能恢复情况来探讨其可行性。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备与试剂

jem 1200ex电镜（日本电子公司），cias-1000型细胞图像分析系统（北京大恒视觉图像公司），四通道肌电图仪（丹麦dantec keypoint），十二烷基硫酸钠（北京华美生物工程公司），脱氧胆酸钠（北京华美生物工程公司），兔抗大鼠s-100（武汉博士得生物工程公司）。

1.2 异种神经去细胞基质膜管的制备

取新鲜兔坐骨神经，切成长10 mm的神经段，按照以下步骤处理：①蒸馏水浸泡12 h；②5%sds（十二烷基硫酸钠）浸泡6 h；③5%脱氧胆酸钠浸泡6 h。重复以上步骤直至将神经段中的细胞成分处理干净。蒸馏水充分冲洗，无菌pbs4℃保存。

1.3 实验动物、地点及分组

健康成年新西兰大耳白兔 1 只，健康成年sd大鼠 30 只，由辽宁医学院实验动物中心提供。生产许可证：scxk（辽2003-0007），使用许可证： syxk（辽2003-0011）。雌雄不限，体重200～250 g，清洁级，常温常湿，正常进食及水。随机分成异种神经去细胞基质膜管（实验组）, 自体神经移植组和硅胶管桥接组（对照组），每组10 只动物。于辽宁医学院附属第一医院外科实验室完成实验。

1.4 手术方法

采用100 g/l水合氯醛0.5 ml腹腔麻醉。股后部正中切口，手术显微镜下解剖坐骨神经，自梨状肌下缘切除8 mm长坐骨神经，任其两端回缩。实验组用10 mm长的处理好的异种神经去细胞基质膜管桥接于神经两断端间的缺损处，用9/0无损伤缝合线将基膜管与神经外膜缝合；自体神经移植组切取10 mm长的坐骨神经后将其翻转后再吻合于原处，硅胶管桥接组用医用硅胶管吻合于神经缺损处。术后使用庆大霉素喷洒于手术切口处，预防感染。

1.5 观察指标

一般观察术后1、2、3、4 个月分别观察各组动物足跟溃疡时间、步态、关节活动。坐骨神经指数(sciatic nerve function index, sfi)计算。sfi值0%～±11%表示神经功能完全正常,-100%表示神经功能完全丧失,-11%～-100%表示部分神经功能恢复。电生理检测坐骨神经动作电位幅度（action potential，ap）和传导速度（mean conduct velocity，mcv）。行he染色图像分析、免疫组化染色及透射电镜观察。

1.6 统计学处理

所有数据用均数±标准差±s来表示，spss10.0统计软件进行方差分析统计。若p<0.05，有统计学意义；p<0.01有显著统计学意义；p>0.05，没有统计学意义。

2 结果

2.1 动物一般观察

术后1 个月时实验组8 只，硅胶管桥接组8 只及自体神经移植组6 只大鼠出现足底踝关节后部皮肤溃疡；其余的大鼠足底红肿。大鼠术侧腿部已经能活动，各足趾呈自然弯曲状态，同时术侧小腿部肌肉均有不同程度的萎缩。术后2 个月时，各组大鼠的足趾仍呈自然弯曲状态，而且硅胶管桥接组6 只，实验组3 只，自体神经移植组2 只术侧足趾与健侧相比出现了不同程度的萎缩，足底的红肿和溃疡和小腿部的肌肉萎缩仍存在。术后3 个月时，硅胶管桥接组出现萎缩的大鼠的情况无明显改善，出现足趾萎缩的6 只大鼠中有3 只萎缩进一步加重，实验组和自体神经移植组各组大鼠的足底的红肿基本消失和溃疡及胶质萎缩情况已经有所恢复。术后4 个月时，实验组、自体神经移植组大鼠的腿部红肿和溃疡已基本消失，除异种神经基质膜管组（实验组）4 只，自体神经移植组3 只腿部肌肉与健侧比较有萎缩外，其余大鼠小腿部肌肉基本恢复正常，而硅胶管桥接组大鼠的红肿和溃疡仍然存在。小腿肌肉呈不同程度的萎缩。硅胶管桥接组4 只，实验组2 只，自体神经移植组2 只脚趾出现明显萎缩外，其余大鼠脚趾仅有轻度萎缩。

2.2 坐骨神经指数（见表1）。

表1 sfi（坐骨神经指数）结果（略）

注：异种神经基质膜管组与硅胶管组和自体神经移植组相比较：* p<0.05，**p<0.01

2.3 电生理检测 术后4个月检测坐骨神经动作电位幅度和传导速度，见表2。

表2 电生理检测结果（略）

注：异种神经基质膜管组与硅胶管组和自体神经移植组相比较：* p<0.05，**p<0.01

2.4 组织学观察

术后4个月实验组动物可见异种神经去细胞基质膜管与大鼠坐骨神经缝合处愈合良好，吻合口光滑，未见有神经瘤形成，也未与周围组织有粘连情况（图1）。自体神经组也愈合良好，没有神经瘤形成及与周围组织粘连情况出现。

2.5 he染色s-100免疫组织化学染色观察

he纵切片染色显示，实验组（图2）桥接处神经结构连续性良好，再生神经全部长入远端，再生神经纤维排列整齐，周围可见大量新生血管，未见有变性坏死及瘢痕化等情况。s-100免疫组织化学染色显示，实验组（图3）与自体神经移植组可见s-100免疫反应阳性的雪旺氏细胞沿神经纤维分布成条带状。

2.6 有髓神经纤维数目及直径 见表3。

表3 图像分析有髓神经纤维数目及直径结果（略）

注：异种神经基质膜管组与硅胶管组和自体神经移植组相比较：*p<0.05，**p<0.01

2.7 透射电镜超微结构观察

异种神经去细胞基质膜管组（图4）的再生的神经纤维较粗大，呈圆型或椭圆型，各条神经纤维的直径比较均匀一致，排列紧密，髓鞘厚度较厚，轴突结构完整。

3 讨论

3.1 关于构建神经再生室的材料选择

近年来随着对神经生物学的深入研究，通过构建神经再生室来修复神经为治疗周围神经缺损开辟了新的途径。为了选取适合构建神经再生室的材料，很多学者做了大量的研究，目前主要有二类，第一类是非生物材料：最初的研究是单纯的应用硅胶管，而后又有学者研究应用可降解的天然材料及人工合成的高分子材料如壳聚糖、胶原、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚己内酯、及其共聚物等制作导管［3］，这些导管在体内可以逐渐被吸收，早期可以维持自身形态，促进周围神经的再生，然后在神经再生完成后，在体内缓慢降解直至被完全吸收，避免了二次手术，在动物实验中也都取得了良好的效果。第二类是生物材料：应用材料包括有自体静脉，自体肌筋膜管，羊膜管以及最近发现的去细胞神经基质膜管等［4］。本实验之所以选取异种神经去细胞基质膜管作为神经再生室的材料，是因为去细胞的神经基质膜管能提供最适合神经生长的接近正常的生理微环境，通过去除引起排斥反应得细胞成份使其与组织有良好的相容性，另外异种神经去细胞基质膜管的构建材料具有来源广泛，可满足临床需要等优势。

3.2 关于处理后的异种神经基质膜管的免疫排斥反应

未去除抗原性的异种神经移植必然会产生免疫排斥反应，bain［5］等研究了新鲜的异种神经移植后发生的排斥反应情况，在移植后出现了大量宿主细胞反应，最终会导致移植的新鲜的异种神经发生变性、坏死，随后肉芽组织增生瘢痕化，阻断神经的再生，而且排斥反应在术后6个月内都持续存在。通常移植后轴突的再生仅有几毫米，达不到修复要求。本实验联合应用十二烷基硫酸钠（sds），脱氧胆酸钠处理新鲜的兔坐骨神经移植段，去除神经移植段中引起排斥反应的神经轴突和髓鞘等细胞成分，在术后4个月时在体观察可见（图1），移植段与大鼠坐骨神经吻合口处光滑，愈合良好，未见神经瘤形成，移植段周围组织也未见有粘连及瘢痕组织形成等情况。he染色也可见再生神经纤维排列整齐，未见有变性坏死及瘢痕化等情况（图2）。可见联合应用十二烷基硫酸钠（sds），脱氧胆酸钠的化学处理方法构建的异种神经基质膜管已经去除了产生免疫原性的基础成份，应用到大鼠体内未见到免疫排斥反应。

3.3 关于去除细胞的化学试剂的选择

dumont ce和sondell m等最先创立了用生物清洁剂tritonx-100来去除神经移植内细胞的方法［6］。此方法可以去除神经移植段内所有的细胞成分，可以保留完整的雪旺氏细胞基底膜及神经内膜，束膜，外膜。从而制成了几乎没有免疫原性的去细胞神经基质膜管。tritonx-100是非离子型去垢剂，是表面活性剂的一种，利用tritonx-100作为去除神经中细胞的方法就是利用了其作为去垢剂的破膜作用，可以破坏细胞膜，使细胞内的成分充分释放出来，从而达到去除新鲜神经内细胞成份，达到去除异种神经的抗原性的作用。十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，sds）又称月桂基硫酸钠（sodium lauryl sulfate，sls）,和脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate）同为阴离子型去垢剂，即阴离子型表面活性剂，在分子生物学实验中被广泛应用于破坏细胞膜，国内外曾报道将十二烷基硫酸钠（sds）用于肌桥、皮肤、瓣膜、心包等组织的脱细胞处理，效果良好［7,8］。目前尚未见到其用于神经脱细胞处理的报道。本实验创新性的联合应用这两种去垢剂处理兔新鲜坐骨神经，去除其中的细胞成份。

以上实验结果表明，联合应用十二烷基硫酸钠（sds）和脱氧胆酸钠处理异种神经构建的异种神经去细胞基质膜管移植后，未见有明显排斥反应发生，术后修复的大鼠坐骨神经各项功能指数已经有部分指标达到自体神经移植的修复效果。（此文图1-4见附页2-3）

【参考文献】

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