连续微量培养液胃癌组织块贴壁培养法
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【关键词】 蛋白质
0 引言
目前采用蛋白质组学对胃癌的研究，多采用胃癌手术,活检标本或现成的胃癌细胞系。但胃癌组织有许多间质成分，比如成纤维细胞，这些都会对胃癌蛋白质组分析产生干扰，而胃癌细胞系虽然细胞种类单一，获取容易，但因传代次数过多，代数不明，其蛋白质表达与在体胃癌细胞相比是否发生变异，均是我们在研究胃癌蛋白质组过程中担忧的问题。而胃癌组织原代培养既能反映原始组织细胞特点，又能排除间质成分的干扰，是研究胃癌细胞分化、形态及功能异常、浸润性、转移性、遗传特征和临床用药的理想材料。为了更好地研究胃癌蛋白质表达情况，我们对原有的胃癌组织原代培养方法加以改良，建立了较成功的培养体系，以期为后续的胃癌蛋白质组学研究和其他相关研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 试剂与标本
rpmi1640，灭活胎牛血清，hepes，青霉素，链霉素，两性霉素b，胰岛素，25cm2培养瓶（铺被鼠尾胶原）;21例胃癌组织取自郑州大学一附院手术标本（2006.04～2006.12），病理确诊均为胃腺癌。
1．2 方法
1．2．1 培养液rpmi1640的配制［1］ 生长培养液：灭活胎牛血清20%,青霉素100u/ml，链霉素100μg /ml，hepes缓冲液25mmol/l，碳酸氢钠20mmol/l，胰岛素0.5u/ml。运输培养液：不含血清且另加两性霉素b 2μg/ml，其余同生长培养液。
起始培养液：不含血清也不加两性霉素，其余同生长培养液。
1．2．2 胃癌组织块种植 去除胃癌组织附带的脂肪、结缔组织及坏死部分，在平皿中用运输培养液洗3次，剪碎胃癌组织成1mm3的小块，接种于涂有鼠尾胶原的培养瓶中，先平置于37℃ 5%co2培养箱中3h左右使组织块边缘干涸，然后补加微量起始培养液[2,3]，37℃静置培养， 24h后换液。
1．2．3 成纤维细胞的去除 采用机械刮除法［4］。把胶塞剪成三角形插在不锈钢丝末端制成橡胶刮头，放入试管中高压蒸汽灭菌后备用。上述组织块培养6d后，将培养瓶置于相差显微镜下观察，有上皮样细胞生长的组织块用记号笔在瓶外做标记，换液时未标记的组织块用橡胶刮头刮掉，有标记的保留并加入培养液继续培养。如有成纤维细胞残留，可重复刮除。
1．2．4 胃癌细胞的鉴定［4］ 胃癌细胞爬片培养，常规he染色，pas染色。
免疫组化sp法检测上皮膜抗原（ema）和癌胚抗原（cea）。
2 结果
从培养的第3d起，部分组织块有上皮样细胞开始向外移行生长，第3d换了全量生长培养液后，我们陆续观察到，有的组织块开始有成纤维细胞向外移行生长，且一个组织块仅见到一种类型的细胞生长，要么是上皮样细胞，要么是成纤维细胞。用橡胶刮头刮除后，成纤维细胞明显减少，通过反复刮除成纤维细胞生长的组织块，最后不存在成纤维细胞的污染和过度生长，胃癌细胞纯化、单一。相差显微镜观察及he染色显示细胞异形性明显。pas染色阳性，显示细胞有丰富的多糖（粘蛋白）。ema及cea染色阳性，表明培养的细胞具有上皮源性和恶性特征。
3 讨论
胃癌组织原代培养在国内外早有尝试，但培养的成功率较低，多年来对胃癌的研究往往采用胃癌组织、细胞系或胃癌原代短期培养（混有非肿瘤细胞［5］）， 而胃癌蛋白质组学研究的兴起使胃癌细胞原代培养迫在眉睫，为此我们于2006年4月～2006年12月对21例胃癌组织进行组织块静置干贴壁原代培养，并在原有培养技术和操作方法的基础上，不断探索改良，建立了行之有效的连续微量培养液组织块贴壁培养法。
胃癌组织必须从经病理证实的肿瘤组织中无菌切取，选择肿瘤块边缘的组织或肿瘤组织与正常组织交界处的组织,因该处肿瘤细胞的活性、 代谢都比较旺盛,易贴壁生长。取材后立即放入运输培养液中保鲜，不含血清，但应加入两性霉素b 2μg/ml 以防霉菌污染，两性霉素b能有效抑制霉菌的生长，但不能在培养液中长期存在，否则对胃癌细胞的生长不利。我们选择在运输胃癌组织和剪碎组织的过程中用运输培养液。取材后应尽早进行培养，否则置4℃冰箱过夜，但不能超过24h。
3．2 剪碎组织和组织块种植
去除胃癌组织附带的脂肪、结缔组织及坏死部分，在平皿中用运输培养液洗3次，移至试管口，用眼科剪剪碎癌组织成1mm3的小块，不宜过细,否则易漂浮。过大则块内细胞长时间得不到营养而死亡。
组织剪碎后，向试管内加2ml起始培养液，将组织块及细胞吹打均匀,吸取适量加于细胞培养瓶的培养面,并用滴管的尖部拨动组织块至密度适当、分布均匀（由于起始培养液较少,所以组织块不能太多，组织块间距0.5cm［3］），然后将培养瓶慢慢立起，吸弃瓶底多余培养液。平置于37℃ 5% co2培养箱中3h左右使组织块边缘干涸，然后补加微量起始培养液（刚好能覆盖培养瓶底面即可,否则组织块易漂浮）静置培养。
3．3 培养瓶的取放方法和换液方法
组织块贴壁培养过程中，换液与观察时培养瓶的取放十分重要。必须先将培养瓶缓慢直立后才能取出培养瓶; 在放入培养箱和做显微镜观察时,须十分缓慢地将培养瓶放平,确保组织块不受液体的晃动而脱落,绝不能将培养瓶平拿起走动。
为确保组织块尽快贴壁，开始培养液用量较少,但为了保持足够的营养及酸硷平衡,必须24h换液1次。换液时培养瓶直立， 吸弃全部旧培养液,加入等量新培养液,微量培养液的培养时间,一般要连续3～7天或更长,视组织块长出细胞的快慢而定。待组织块周围长出细胞后,换液时才能将培养液增加到常规量或更多,并且应保持3～5天的静置培养,以利于细胞的迅速生长。
因为运输用培养液和起始培养液均未加血清，成纤维细胞的生长依赖于血清的存在，所以生长受到抑制，而肿瘤细胞的生长不依赖血清的存在，所以在第3天，我们首先观察到有上皮样细胞从某些组织块向外移行生长，而不是成纤维细胞。到第3天换为全量生长培养液，我们陆续观察到，有的组织块开始有成纤维细胞向外移行生长。
3．4 成纤维细胞清除时机和方法的选择
肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清/无血清培养基中也能生长，肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌性产生促生长物质之故，但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。因此早期采用微量无血清的起始培养液培养组织块，胃癌细胞和成纤维细胞的生长都会有所减慢。因此在第三天观察到某些组织块有上皮样细胞长出后，我们并不急于清除成纤维细胞，而是换成全量含20%胎牛血清的生长培养液继续稳定培养3天以上，等有大量组织块都有细胞长出后再开始成纤维细胞清除。采用机械刮除法简单可靠，能从根本上把长出成纤维细胞的组织块及周围的细胞清除掉，避免了成纤维细胞的污染和过度生长现象，使胃癌细胞纯化率达100%。
本文建立的连续微量培养液组织块贴壁培养法,贴壁生长率明显高于常规组织块贴壁法。 常规组织块培养法［4］经2～4小时干涸翻转培养瓶后,大部分又被浮起,或者组织块虽贴壁较好,但其周围不易长出细胞,可能是组织细胞长时间得不到营养而受到损伤。 因此我们采用在整个培养工作中， 胃癌组织离开人体后一直不脱离培养液,保证组织活力。其特点是：组织块在营养充足的情况下,长时间不被浮起,给组织块贴壁生长创造了良好的环境；早期无血清培养液的应用抑制了成纤维细胞的快速生长，使上皮样肿瘤细胞的移行生长早于成纤维细胞，并适时清除了成纤维细胞,从而提高了肿瘤细胞培养的成功率。
【参考文献】
［1］ ［澳］r费雷纳弗雷谢尼主编.章静波等译.人肿瘤细胞培养［m］.第1版.北京：化学工业出版社，2006.19?20.
［2］ 马世兴,王峰.连续微量培养液强行细胞贴壁培养法［j］.细胞与分子免疫学杂志，1998,14(4):308?309.
［3］ 杨志明.组织工程［m］.第1版，北京：化学工业出版社，2002，19?21.
［4］ 司徒镇强，吴军正.细胞培养［m］.西安：世界图书出版西安公司， 2004,72?73，83，189?196.