氟伐他汀对家兔颈动脉粥样斑块巨噬细胞和基质金属蛋白酶的影响

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摘要：目的观察高胆固醇血症家兔颈动脉粥样斑块内炎性巨噬细胞与MMP－2、MMP－9的表达情况，并研究氟伐他汀干预对巨噬细胞聚集和基质金属蛋白酶(MMPs)表达的影响，探索他汀类药物在稳定颈动脉斑块中的作用及机制。方法24只家兔随机分为对照组、高脂组和治疗组，每组8只，分别给予普通饲料、高脂饲料和高脂饲料加氟伐他汀喂养，测定不同时间点血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL－c)水平。喂养第12周时处死动物，取颈动脉进行石蜡切片，测量并计算颈动脉I/M比值，SP法进行CD68、MMP－2和MMP－9免疫组织化学染色。结果治疗组血清TC、LDL－C浓度明显低于高脂组(P＜0.01)。治疗组I/M比值明显低于高脂组(P＜0.01)。高脂组颈动脉斑块中见大量CD68阳性细胞。而治疗组CD68阳性细胞数显著少于高脂组(P＜0.01)。颈动脉斑块中MMP－2、MMP－9阳性细胞和染色强度明显增加，治疗组MMP－2和MMP－9的表达较高脂组显著减少(P＝0.002和P＝0.016)。结论 氟伐他汀治疗可以抑制高胆固醇血症家兔颈动脉粥样斑块的形成，减轻斑块内巨噬细胞的浸润并抑制MMP－2和MMP－9的产生，从而起到稳定斑块的作用。

关键词：动脉粥样硬化；颈动脉狭窄；基质金属蛋白酶；氟伐他汀；脑梗死

中图分类号：R543.5 R256.2 文献标识码：A 文章编号：1672―1349(2007)04―0324―03

动脉粥样硬化斑块内单核一巨噬细胞等炎性细胞聚集，合成基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)增多，可能是造成纤维帽变薄、斑块不稳定的重要因素[1]。易损斑块表面溃疡形成、破裂，引起动脉内血栓形成或斑块脱落成微栓子，是缺血性卒中的主要发病机制。他汀类药物还原酶抑制剂(HMG－CoA)可以通过减轻炎症反应、改善内皮细胞功能等来阻止斑块形成并稳定斑块[2，3]，从而有效地预防和控制动脉粥样硬化的形成，是近年研究的热点，但其确切机制尚不明了，不同的药物作用也不尽相同。本研究拟通过高脂饮食建立家兔动脉粥样硬化模型，观察颈动脉粥样斑块内炎性巨噬细胞与明胶酶(MMP－2、MMP－9)的表达情况，并研究氟伐他汀干预对炎症反应和MMPs表达的影响，从而探索他汀类药物在稳定颈动脉斑块中的作用及机制。

1　材料与方法

1.1 动物模型的建立和分组 健康4月龄新西兰白兔24只(由南通大学实验动物中心提供)，雌雄各半，体重(2.0～2.5)kg。简单随机法分为3组，每组8只，对照组给予普通颗粒饲料喂养；高脂组予高脂饲料(1.5％胆固醇、1％猪油和4％蛋黄)；治疗组的喂养在高脂组的基础上添加氟伐他汀(来适可，北京诺华制药有限公司)20 mg/(kg・d)。1.2血标本的留取分别于实验开始前及开始后第4周、第8周、第12周清晨空腹取各组实验动物耳缘静脉血0.5 mL，酶法测定血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL－C)。

1.3　病理标本的留取和处理于第12周末放血法处死全部动物，将兔两侧颈动脉由起始处(左侧起始于主动脉弓，右侧起始于无名动脉)经分叉至入颅前全部取出，清除血管外周结缔组织后附面纵行剖开，肉眼观察颈动脉斑块形态、数量，取组织经10％甲醛固定，进行常规石蜡制片，切片厚5um，HE染色后光镜下观察颈动脉粥样斑块，Image－Pro Plus 6.0图像分析系统测量颈动脉内膜厚度(I)、中层厚度(M)并计算I/M值，每例标本在不同部位测量5次，取平均值。

1.4　免疫组织化学染色 采用SP法，CD68(MAB－0041)、MMP－2(MAB－0244)、MMP－9(MAB－0245)单克隆抗体(即用型)和SP试剂盒(KIT－9702)，均购自福州迈新生物技术公司。切片经高压锅抗原修复，DAB染色。

1.5　免疫组化结果的评定CD68、MMP－2、MMP－9阳性定位于胞质和胞膜，为浅黄色、棕黄色或棕褐色。在斑块的肩部、基底部和纤维帽各随机选取4个高倍视野(×200)，计数CD68阳性细胞，取其平均值。MMP－2和MMP－9染色结果的评定参照许良中等[4]的判断标准进行半定量分析，由两位病理科医师采用盲法评定，将染色强度打分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色，再将阳性细胞所占的百分比打分：0分为阴性，1分为阳性细胞≤lO％，2分为11％～50％，3分为51％～75％，4分为＞75％，根据染色强度与阳性细胞百分比的乘积分成4个等级：(－)，≤3分；(＋)，4分～6分；(＋＋)，7分～9分；(＋＋＋)，10分～12分。

1.6　统计学处理 计量资料以均数±标准差

表示，SP&S 10.O统计软件进行方差分析，组间比较采用LSD法，等级资料的组间比较采用Kruskal－Wallis秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1 血清学指标的变化 实验前各组家兔血清脂质间均无明显差异。喂养第12周时，高脂组外周血TC(24.07±2.27)mmol/L、LDL－C(16.4±2.7)mmol/L水平，均显著高于对照组的TC(1.55±1.05)mmol/L、LDL－C(0.6±0.5)mmoL/L．差异有统计学意义(P＜0.01)；治疗组治疗后均较高脂组显著降低(P＜0.01)，各组间TG和HDL－C水平无统计学意义。

2.2 形态学观察 HE染色光镜下观察颈动脉，正常对照组内膜见单层扁平内皮细胞，结构完整，中膜平滑肌细胞与内弹力层平行，排列规整；高脂组动脉壁明显增厚，斑块向管腔内突起，管腔缩小，内膜明显增厚，内皮下见大量泡沫细胞，可见崩解破碎，有脂质沉积，细胞大小不等，排列紊乱；而治疗组动脉壁内膜厚度明显小于高脂组，内膜完整，泡沫细胞减少，脂质沉积少。高脂组I/M比值(1.317±0.008)较对照组(0.020±0.006)显著增高(P＜0.01)，而治疗组I/M比值(0.544±0.008)较高脂组显著降低(P＜0.01)。

2.3 CD68阳性细胞 对照组内膜及内膜下仅见少量CD68阳性细胞；高脂组颈动脉斑块中见大量CD68阳性细胞，散在分布；而治疗组CD68阳性细胞数显著少于高脂组(P＜0.01)。

2.4

MMP－2、MMP－9表达结果对照组仅见少量MMP－2、MMP－9阳性细胞。颈动脉斑块中MMP－2、MMP－9阳性细胞和染色强度明显增加，主要位于斑块核心的周围，尤其是在斑块的肩部和纤维帽中，治疗组MMP－2和MMP－9的表达较

高脂组显著减少。详见表1。

3　讨　论

动脉粥样硬化斑块破裂、溃疡，引起动脉内血栓形成或斑块脱落成微栓子，是冠心病和缺血性卒中的主要发病机制，提高动脉粥样硬化斑块的稳定性，是减少急性冠脉综合征和缺血性卒中的重要措施。易损(不稳定)斑块的主要形态学特征包括：巨噬细胞聚集为主的活动性炎症、薄的纤维帽和大的脂质核心、纤维帽的破裂等，基质消化酶活性的增加也促成了斑块的不稳定性[5]。MMPs是一组含有钙和锌离子的具有相同功能区域和作用机制的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白水解酶超家族，主要由间质细胞和一些炎性细胞合成和分泌，并受多种细胞因子调节，它们在维持ECM合成与降解的动态平衡，生理性和病理性血管重建中和保持纤维帽的完整方面发挥重要作用，可能是维持斑块稳定的一个重要因素。在动脉粥样斑块中，MMP－2和MMP－9活性增强[6]。在颈内动脉高度狭窄的病人中，MMP－9蛋白的水平和活性与近期脑血管事件的发生显著相关．提示其在颈内动脉粥样硬化斑块纤维帽的破坏中起定作用[7，8]。动脉粥样斑块内炎性细胞主要是单核－巨噬细胞系统，其产生的主要是MMP－2和MMP－9，CD68是单核巨噬细胞的特异性抗原。本研究显示，动脉粥样斑块中巨噬细胞明显增多，高脂组MMP－2和MMP－9表达较对照组显著增多，说明炎症反应以及由炎性细胞产生的MMPs促成了颈动脉粥样硬化的形成，并可能进一步导致斑块的不稳定。

他汀类药物能有效地预防和控制动脉粥样硬化，其主要的作用机制为阻断胆固醇的生物合成、降低血清LDL－C浓度等。本研究中，氟伐他汀显著降低高胆固醇血症家兔血清TC和LDL－C浓度，同时，氟伐他汀治疗显著抑制了颈动脉粥样斑块的形成，I/M比值较高脂组明显降低。近年的基础和临床研究均提示，他汀类药物还可以通过减轻炎症反应、改善内皮细胞功能等来阻止斑块形成并稳定斑块[2]，但其机制尚不明了。体外研究提示，辛伐他汀能抑制巨噬细胞表达和分泌MMP－2、MMP－9[9，10]，而Crisby等[11]在一项对照研究中却发现，接受普伐他汀治疗的病人斑块中MMP－l和MMP－9水平与对照组没有差别，他汀类药物是否会影响到MMP的产生尚不明确。在体研究显示，氟伐他汀治疗显著抑制了动脉粥样斑块内巨噬细胞的聚集，同时，MMP－2和MMP－9表达的细胞数和量较高脂组显著减少，这说明氟伐他汀抑制了斑块内的炎症反应，并可能使基质破坏减少，从而起到稳定斑块的作用。

本研究结果提示，氟伐他汀治疗可以抑制颈动脉粥样斑块的形成，减轻斑块内炎性巨噬细胞的浸润并抑制MMP－2和MMP－9的产生，从而起到稳定斑块的作用，进一步阐明了他汀类药物的作用机制，同时，也为MMP抑制药物的应用提供了线索和依据。

参考文献：

[1]　Galis ZS，Khatri JJ．Matrix metalloproteinases in vascular remodelingand atherogenesis：The good，the bad，and the ugly[J]．Cire Res，2002，90(3)：251―262．

[2] Jain MK，Ridker PM．Anti－inflammatory effects of statins：Clinicalevidence and basic mechanisms[J]．Nat Rev Drug Discov，2005，4(12)：977―987．

[3]　Stoll G，Bendszus M．Inflammation and atherosclerosis：Novel insightsinto plaque formation and destabilization[J]．Stroke，2006，37(7)：1923―1932．

[4]　许良中，杨文涛免疫组织化学反应结果的判断标准[J]．中国癌症杂志，1996，6(4)：229―231．

[5] Nagbavi M，Libby P，Falk E，et al． From vulnerable plaque to vul-nerable patient：A call for new definitions and risk&saessment strate-gies[J]．Circulation，2003，108(14)：1664―1672．

[6] Galls ZS，Sukhova GK，Lark MW，et al，Increased expression ofmatrix metalloproteinases and matrix degrading activity in vulnerableregions of human atherosclerotic plaques[J]．J Clin Invest，1994，94(6)：2493―2503．

[7]　Loftus IM，Naylor AR，Goodall S，et al．Increased matrix metallo-proteinase－9 activity in unstable carotid plaques：A potential role in a-cute plaque disruption[J]．Stroke，2000，31(1)：40―47．

[8]　Papalambros E，Sigala F，Georgopoulos S，et al．Vascular endothe-lial growth factor and matrix metalloprotdnase 9 expression in humancarotid atherosclerotic plaques：Relationship With plaque destabilizationvia neovascularization[J]．Cerebrovasc Dis，2004，18(2)：160―165．

[9]　曹雅雯，胡大一．辛伐他汀对巨噬细胞基质金属蛋白酶－2、9表达及分泌的影响[J]．中华心血管病杂志，2004，32(7)：640―642．

[10]　陈倩，吴宗贵，张玲珍普伐他汀对培养巨噬细胞表达基质金属蛋白酶活性的影响[J]．中华老年心脑血管病杂志，2003，5(5)：331―333．

[11] Crisby M，Nordin－Fredriksmn G，Shah PK，et al．Pravastatintreatment increases collagen content and decreases lipid content．in-flammation，metalloproteinases，and cell death in human carotidplaques：Implications for plaque stabilization[J]．Circulation，2001，103：926―933．

作者简介：周永(1972―)，男，毕业于南京医科大学，主治医师，硕士，现工作于江苏省南通市第一人民医院(邮编：226001)；黄怀宇、黄志东、顾承志、朱向阳，工作于江苏省南通市第一人民医院。

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