紫柏凝胶对宫颈癌SiHa细胞的影响
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摘要：目的 探讨紫柏凝胶药物血清作用于高危型人瘤病毒感染相关性宫颈癌siha细胞的免疫学反应机制。方法 采用细胞培养及免疫组化方法，用不同浓度紫柏凝胶药物血清作用宫颈癌SiHa细胞24、48、72 h后，分别标记出相同作用时间段不同浓度下及不同时间段相同浓度下白细胞介素（IL）-6、IL-10、CD83、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的光密度，通过计算平均光密度，分析药物作用与免疫因子IL-6、IL-10、CD83、TNF-α表达的量效与时效关系。结果 随着药物血清浓度及作用时间的增加，IL-6及TNF-α的免疫表达均逐渐减弱，CD83及IL-10的免疫表达均逐渐增强（P
关键词：高危型人瘤病毒；药物血清；紫柏凝胶；免疫功能
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.017
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）07-0060-03
Effect of Zibai Gelatin for Cervical Cancer SiHa Cells XU Kai1， XUE Xiao-ou2， LI Jian3， MA Xiu-li2， QIN Lei2 （1.Zhejiang Provincial Hospital of TCM， Hangzhou 310006， China；2.Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China；3.Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）
Abstract：Objective To investigate the immunological reaction mechanism of medicated serum in Zibai Gelatin for SiHa cells of the cervical cancer infected by high risk human papilloma virus （HPV）. Methods Through immunohistochemical comparison and the cell culture， and after medicated serum was administrated to SiHa cells of cervical cancer for 24 h， 48 h， and 72 h， optical densities of IL-6， IL-10， CD83 and TNF-α in the same time but different concentrations and different times but the same concentration were observed. Relationships of dose-effect and time-effect between expressions of IL-6， IL-10， CD83 and TNF-α and medicine action were analyzed by calculating average optical density. Results With the increase of medicine concentration and administration time of Zibai Gelatin， the expressions of IL-6 and TNF-α gradually decreased， while the expressions of CD83 and IL-10 gradually increased （P
Key words：HPV；medicated serum；Zibai Gelatin；immunologic function
目前认为，宫颈高危型人瘤病毒（HR-HPV）感染是宫颈癌发病的主要因素之一。宫颈局部的免疫功能变化在宫颈感染HR-HPV后与病变的发展存在着联系，宫颈局部的免疫功能紊乱可能在宫颈疾病进展的过程发挥着某种作用[1]。紫柏凝胶外治宫颈HR-HPV感染，临床疗效肯定[2]，但中药抑制降低宫颈HR-HPV
基金项目：北京市科技计划“十病十药”中药专项（2015年）；北京市教育委员会共建项目建设计划（2011年）
通讯作者：薛晓鸥，E-mail：
复制增殖的作用机制目前尚不明确。有研究显示，药物发挥抗HR-HPV的作用实质是改善宫颈局部免疫环境[3]。本研究通过观察紫柏凝胶对宫颈癌SiHa细胞的影响，探讨其抑制宫颈HR-HPV的免疫作用机理。
1 实验材料
1.1 动物
2只成年雌性中华白兔，体质量约2.5 kg，购于北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司，许可证号SCXK（京）2010-0001。饲养于北大医学部普通动物实验室。
1.2 药物及药物血清制备
将紫柏凝胶组方按原药材比例（紫草20 g，黄柏20 g，百部20 g，儿茶20 g）配成平均为150 g/剂的颗粒剂，以1 g/kg给药量换算进行兔喂养，每日3次，连续3个月后，末次给药前8 h禁食不禁水，末次给药后1 h，水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，37 ℃水浴静置30 min，3000 r/min离心10 min，无菌分离血清，血清置于60 ℃恒温水浴30 min处理，进行补体灭活，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装于1 mL无菌EP管中，置于-80 ℃冰箱中冻存，共取出紫柏凝胶药物血清（DS）50 mL，备用。
1.3 细胞株
人子宫颈鳞癌SiHa细胞株（HPV16型感染），购自中国协和医科大学基础医学院细胞中心，传代培养（Cell Resource Center IBMS.CAMS/PUMC）。
1.4 主要试剂与仪器
最低限度基础（MEM）培养基，GIBCO；胎牛血清（FBS），Hyclone；胰酶-EDTA，MACGENE；DMSO，AMIRSCO；Rabbit Anti-白细胞介素（IL）-6、Rabbit Anti-IL-10、Rabbit Anti-CD83、Rabbit Anti-肿瘤坏死因子-α（TNF-α），Bioss；通用二抗山羊抗兔单克隆抗体，CWBIO；抗体稀释液，INVITROGEN；DAB显色试剂盒，CWBIO。程序冻存盒（北京泽平科技有限责任公司），DPH-360型电热恒温培养箱（北京光明医疗仪器厂），海尔BD-2195冷柜（海尔集团），OLYMPUS光学显微镜（日本OLYMPUS公司），尼康BR-3.2图像分析系统（日本Nikon公司），HC-2514高速离心机（ZONKIA）。
2 实验方法
2.1 细胞培养
宫颈癌SiHa细胞培养在含有10%胎牛血清的MEM（EBSS）培养液中，37 ℃、5%CO2孵箱中培养，根据细胞生长情况3～4 d传代1次，按1∶3～6的比例传代分瓶。
2.2 药物作用
将处于对数生长期的宫颈癌SiHa细胞接种于48孔板中，每孔密度为2.0×105个/300 μL，培养液为含90%MEM培养基、含10%不同配比量的FBS及DS（4∶0、3∶1、2∶2、1∶3、0∶4）。设平行重复对照3组，实验重复3次。
2.3 细胞免疫组化方法
终止细胞培养后，行PBS冲洗；4%多聚甲醛固定15 min，500 μL/孔；空气干燥5 min；冲洗；0.5%TritonX-100（PBS稀释）孵育20 min，300 μL/孔；冲洗；3%H202孵育15 min，300 μL/孔；冲洗；一抗（1∶150）孵育，37 ℃，1～2 h，100 μL/孔；冲洗；二抗（1∶200）孵育，37 ℃，0.5～1 h，100 μL/孔；冲洗；DAB显色3～5 min，100 μL/孔；冲洗；苏木素（1∶5稀释）复染2 min，100 μL/孔；冲洗；照相。
2.4 观察指标
不同浓度DS作用宫颈癌SiHa细胞24、48、72 h，分别标记相同时间段不同浓度及不同时间段相同浓度IL-6、IL-10、CD83、TNF-α表达的光密度。分析DS作用宫颈癌SiHa细胞与4个因子表达的量效关系及时效关系。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析，采用IPP软件进行各时点平均光密度分析。实验数据以―x±s表示，计量资料采用t检验，单向有序的计数资料采用卡方检验。检验水准α=0.05。
4 结果
4.1 药物血清作用宫颈癌SiHa细胞与相关免疫因子表达的量效关系
不同浓度DS作用宫颈癌SiHa细胞24、48、72 h后，随着药物浓度的增加，IL-6及TNF-α表达逐渐下降，而CD83及IL-10表达逐渐升高；IL-6、TNF-α表达与药物浓度呈负相关，而CD83、IL-10表达与药物浓度呈正相关；IL-6、TNF-α、CD83及IL-10在各浓度间表达均存在差异（P
表1 作用24 h各组宫颈癌SiHa细胞与免疫因子表达的量效关系
（―x±s，平均光密度值）
组别 IL-6 IL-10 TNF-α CD83
10%FBS 0.38±0.07 0.35±0.03 0.35±0.04 0.26±0.03
2.5%DS+7.5%FBS 0.32±0.06 0.37±0.04 0.32±0.03 0.28±0.02
5%DS+5%FBS 0.28±0.04 0.38±0.05 0.30±0.02 0.31±0.01
7.5%DS+2.5%FBS 0.27±0.04 0.39±0.05 0.28±0.01 0.34±0.01
10%DS 0.25±0.01 0.41±0.06 0.23±0.01 0.37±0.01
t绝对值 13.031 38.000 14.690 15.718
P值 0.000 0.000 0.000 0.000
表2 作用48 h各组宫颈癌SiHa细胞与免疫因子表达的量效关系
（―x±s，平均光密度值）
组别 IL-6 IL-10 TNF-α CD83
10%FBS 0.39±0.05 0.34±0.04 0.34±0.03 0.26±0.02
2.5%DS+7.5%FBS 0.29±0.04 0.37±0.02 0.30±0.02 0.29±0.02
5%DS+5%FBS 0.25±0.03 0.40±0.03 0.27±0.01 0.33±0.01
7.5%DS+2.5%FBS 0.22±0.04 0.43±0.04 0.25±0.02 0.36±0.02
10%DS 0.16±0.02 0.46±0.03 0.19±0.03 0.42±0.03
t绝对值 6.824 18.856 10.757 11.933
P值 0.002 0.000 0.000 0.000
表3 作用72 h各组宫颈癌SiHa细胞与免疫因子表达的量效关系
（―x±s，平均光密度值）
组别 IL-6 IL-10 TNF-α CD83
10%FBS 0.38±0.06 0.35±0.04 0.33±0.02 0.25±0.02
2.5%DS+7.5%FBS 0.30±0.06 0.39±0.03 0.29±0.02 0.30±0.01
5%DS+5%FBS 0.23±0.03 0.43±0.04 0.23±0.04 0.39±0.03
7.5%DS+2.5%FBS 0.17±0.04 0.48±0.05 0.19±0.01 0.45±0.02
10%DS 0.10±0.03 0.52±0.04 0.12±0.02 0.53±0.04
t绝对值 4.831 14.262 6.282 7.625
P值 0.008 0.000 0.003 0.002
4.2 药物血清作用于宫颈癌SiHa细胞与相关免疫因子表达的时效关系
相同浓度DS分别作用于宫颈癌SiHa细胞24、48、72 h后，随着药物作用时间的增加，IL-6、TNF-α表达逐渐下降，CD83、IL-10表达逐渐升高；IL-6、TNF-α表达与药物作用时间呈负相关，而CD83、IL-10表达与药物作用时间呈正相关；IL-6、TNF-α、CD83及IL-10不同作用时间的表达差异均有统计学意义（P
表4 10%DS作用宫颈癌SiHa细胞与免疫因子表达的时效关系
（―x±s，平均光密度值）
时间 IL-6 IL-10 TNF-α CD83
24 h 0.25±0.01 0.41±0.06 0.23±0.01 0.37±0.01
48 h 0.16±0.02 0.46±0.03 0.19±0.03 0.42±0.03
72 h 0.10±0.03 0.52±0.04 0.12±0.02 0.53±0.04
t绝对值 5.900 14.571 5.600 9.311
P值 0.024 0.005 0.030 0.011
5 讨论
本实验结果表明，紫柏凝胶作用宫颈癌SiHa细胞，能有效改善宫颈局部的免疫功能，使局部炎症反应降低。实验所选免疫因子具有特异性强的特点，故作为药物血清作用后观察的靶向目标。其中CD83分子是凋亡小体，研究发现，CD83与宫颈的肿瘤细胞浸润分化密切相关[4]，当正常凋亡减少，炎症介质增多，随之而来的则是宫颈病变进展，CD83因子受到抑制，而当药物发挥作用时，对宫颈微环境进行修复，则正常的凋亡使得CD83因子高表达。IL-6在免疫调节中同样发挥着重要作用，药物使免疫功能得到恢复，表现为促炎因子IL-6的表达明显下降。对宫颈HR-HPV感染进行有效的药物干预，会使IL-10表达上升，IL-10不但能影响免疫系统，还能通过调节相关的细胞因子来影响机体内的生理病理过程。TNF-α在宫颈病变及宫颈恶性肿瘤疾病中都是重要的介导细胞因子，其主要具有促炎的作用，从而促进炎症及肿瘤生长，故与宫颈肿瘤疾病相关。在使用药物干预情况下，TNF-α的表达会发生明显变化。宫颈HR-HPV感染后，局部免疫功能平衡被破坏[5]，宫颈HR-HPV持续性感染的患者，主要存在宫颈局部免疫功能低下及HR-HPV病毒免疫逃逸作用。Clarke等[6]发现，HR-HPV感染机体后，会阻断细胞信号的传递，引起局部的炎症反应。宫颈局部由于受到炎症的刺激，会分泌相应的抑炎细胞因子，对宫颈局部的免疫反应有一定影响，能够激活局部免疫系统作用。无论是病毒感染之后，或宫颈癌前病变，还是宫颈肿瘤的发病，其周围均会有炎性介质的浸润，局部免疫系统功能受到抑制，炎症浸润能够体现其程度，也会使疾病进展，因此，改善宫颈周围炎性浸润，可能对宫颈HR-HPV感染的治疗有益。
随着宫颈组织的损伤程度增加，炎症浸润增加，促炎因子大量表达，抑炎因子表达受到抑制。持续性的宫颈HR-HPV病毒感染导致宫颈疾病的恶变，发展成宫颈癌，这一点不容忽视。阴道微生态环境的平衡，有赖于寄居在阴道四周的侧壁黏膜中各种微生物之间的平衡关系，它们相互作用，共同构成防御屏障生物膜。对于宫颈疾病免疫防治的关键问题主要在于如何诱发有效的宫颈HR-HPV特异性免疫防御，从而使宫颈病变逆转。本实验中，紫柏凝胶作用宫颈癌细胞后，能够抑制病毒繁殖，减轻局部炎症，与临床上使用紫柏凝胶能够有效降低HR-HPV的病毒载量相符[2]。紫柏凝胶能够通过改善宫颈局部免疫功能，抑制局部炎症反应，有利于抑制HR-HPV，但需要有相关疾病实验进一步明确本方对HR-HPV病毒的作用机制。
参考文献：
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[4] Goswami B， Rajappa M， Sharma M， et al. Inflammation：its role and interplay in the development of cancer， with special focus on gynecological malignancies[J]. Int J Gynecol Cancer，2008，18（4）：591-599.
[5] 田小英，廖秦平.阴道微生态与妇科肿瘤的研究[J].中国微生态学杂志，2013，25（7）：866-868.
[6] Clarke DT， Irving AT， Lambley EH， et a1. A novel method for screening viral interferon-resistance genes[J]. J Interferon Cytokine Res，2004，24（8）：470-477.
（收稿日期：2014-11-08；编辑：华强）