几类实体肿瘤对IFN?α 2a治疗敏感性与其细胞表面受体表达的关系

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作者：刘艳，韩苇，颜真，张英起

【摘要】 目的： 探讨肿瘤细胞表面干扰素α受体的表达与其肿瘤对ifn?α 2a 治疗 敏感性之间的关系. 为建立干扰素α敏感肿瘤的快速评价 方法 奠定基础. 方法： mtt法体外筛选ifn?α 2a敏感与抗性肿瘤细胞株，选取人肺腺癌细胞a549，spc?a?1，glc?82和人低分化胃腺癌细胞mkn?45 共4株细胞；通过构建荷瘤裸鼠模型，证实不同肿瘤对干扰素治疗的敏感性存在差异. 流式细胞术、免疫组织化学、western blot检测肿瘤细胞表面ifn?α受体的表达差异. 结果： 体内、体外实验结果表明:a549，spc?a?1为ifn?α 2a敏感性细胞株，mkn?45，glc?82为ifn?α 2a抗性细胞株. 细胞和组织水平检测的结果表明：表达量由高到低依次为a549，spc?a?1，mkn?45，glc?82. 结论： ifn?α受体表达的高低与肿瘤细胞对干扰素的敏感性具有密切的相关性，对实现有针对性的个体化治疗具有一定的指导意义.

【关键词】 干扰素α；受体,干扰素α；敏感性与特异性

【abstract】aim： to explore the relationship between interferon?α receptor expression on tumor cell surface and tumor sensitivity to ifn?α 2a treatment so as to develop a new method for quick identification of ifn?α sensitive tumors. methods： mtt assay was adopted to differentiate the sensitive and resistant cell lines to ifn?α. we chose four cell lines, human lung adenocarcinoma (a549, spc?a?1, glc?82) and poorly differentiated human stomach adenocarcinoma cell cine (mkn?45) to establish tumor?bearing mice, and to further detect the sensitivity difference to ifn?α 2a. the n the expression difference of interferon?α receptor (ifnar) was determined by flow cytometry, immunohistochemistry and western?blot. results: data in vivo and in vitro indicated that a549 and spc?a?1 were cell lines sensitive to ifn?α 2a and mkn?45 and glc?82 were ones resistant to ifn?α 2a. the expression of ifnar on a549, spc?a?1, mkn?45, glc?82 was decreased in a stepwise manner. conclusion: the sensitivity of solid tumor to ifn?α therapy is closely related with the ifnar expression on tumor cell surface, and this result might be helpful for the realization of individualized therapy.

【keywords】 interferon?alpha； receptors, interferon?α；sensitivity and specificity

0引言

干扰素作为最早发现、首个克隆化并 应用 于临床治疗疾病的细胞因子，主要通过诱导一系列细胞效应蛋白表达而发挥抗病毒、抗肿瘤和调节免疫应答的作用［1］. 目前 除了用于慢性乙型、丙型肝炎的抗病毒治疗，在肿瘤治疗方面的应用价值也已得到肯定. 但由于其具体的分子生物学机制尚不十分清楚，所以在肿瘤的临床治疗中存在很多 问题 ，部分肿瘤经干扰素治疗后具有良好的效果，但很多肿瘤对干扰素的治疗并不敏感，并易产生毒副作用，这在很大程度上限制了干扰素在临床的广泛应用［2］. 我们通过探究不同细胞对干扰素治疗敏感性差异的原因，为实现针对性较强的个体化治疗奠定基础.

1材料和方法

1.1材料

人肺腺癌细胞系 a549，spc?a?1，glc?82和人低分化胃腺癌细胞系mkn?45均由第四军医大学生物制药学教研室保存. rpmi1640（美国gibco）；小牛血清（fcs，杭州四季青）；ifn?α 2a（瑞士roche）；mtt（amresco）；鼠抗人干扰素α/β受体mab（chemicon公司）；β?actin mab（cell signaling）；hrp标记山羊抗小鼠二抗、dab显色试剂盒（北京中杉）；裸小鼠(balb/c nu/nu)，雄性, 90只，4～6 wk龄, 体质量18～20 g（第四军医大学实验动物中心）；即用型快速免疫组化maxvision试剂盒（福州迈新生物）；流式细胞仪（美国becton dickinson）；550型酶标仪(美国bio?rad).

1.2方法

1.2.1ifn?α 2a的抗细胞增殖作用mtt法，取细胞悬液，5×103个/孔接种于96孔板中，每孔100 μl, 37℃，50 ml/l co2 培养6 h后取出，弃培养液，分别加入药物终浓度为5×104，1×105，5×105，1×106，5×106 u/l的1640培养液，每孔100 μl, 每组3个复孔，对照组仅加培养液，孵育48 h，加5 g/l mtt液20 μl，4 h后弃上清，加二甲基亚砜(dmso) 100 μl，室温振荡10 min，酶标仪测定a490 nm. 细胞抑制率（%）= ［1-(实验组a490 nm/对照组a490 nm)］×100%.

1.2.2 抑瘤实验取浓度为1×1011个/l的细胞悬液0.1 ml, 于裸鼠背部皮下接种，待肿瘤直径长至4 mm以上时，淘汰肿瘤体积过大、过小的裸鼠，将合格动物随机分为对照组、干扰素低剂量治疗组（3×106 u/kg）和高剂量治疗组（9×106 u/kg），每组6只. 随后肌肉内注射治疗，1次/d, 对照组为生理盐水. 每3～4 d用1/50 mm精度游标卡尺测肿瘤的长径和短径，按下式 计算 肿瘤体积. 肿瘤体积(mm3)=肿瘤长径(mm)×肿瘤短径（mm）2×0.52. 末次给药后次日称体质量，处死动物，解剖剥离瘤块称瘤质量，计算抑瘤率. 抑瘤率（肿瘤生长抑制率）= ［对照组平均瘤质量－给药组平均瘤质量］/对照组平均瘤质量×100%.

1.2.3流式细胞术检测ifn?α受体制备细胞悬液，3×105个细胞移入小离心管，正常山羊血清封闭（1∶20稀释）, 0.1 mg/l ifnar mab 20 μl，4℃孵育30 min, 离心，5 μl工作浓度的fitc标记的山羊抗小鼠二抗，4℃，30 min，离心，加入500 μl固定液，流式细胞仪检测. 实验时设同型对照组.

1.2.4肿瘤组织冰冻切片的制备取4株细胞的荷瘤裸鼠，处死后剥离瘤组织置于-80℃保存，切片时将瘤块放在标本座上，包埋剂oct包埋，冰冻切片机切片，将平整的切片贴附在处理好的载玻片上，稍风干后置于冷丙酮中固定25～30 min, 置于标本盒中-80℃待用.

1.2.5免疫组化检测表面受体分布冰冻切片经 h2o2封闭内源性过氧化物酶，2 mg/l鼠抗人ifnar mab，湿盒中4℃过夜；适量即用型快速免疫组化maxvision试剂，室温10～15 min，dab显色5 min，苏木精衬染，封片，显微镜下观察拍照. 以pbs替代一抗作阴性对照.

1.2.6western blot检测ifnar的蛋白表达水平参照分子克隆方法提取4株细胞总蛋白，lowry?s法蛋白定量，sds?page电泳分离后将凝胶中蛋白质湿转法移至nc膜上，封闭，稀释的ifnar mab（1∶1000），4℃过夜，工作浓度的辣根过氧化物酶（hrp）标记的羊抗鼠二抗，室温1 h，ecl发光显色液显色，暗室中x光片曝光. 每步洗膜用tbst洗3次，5 min/次.

统计学处理：用spss11.0统计软件，数据以x±s表示，统计 分析 方法采用lsd?t检验，以p＜0.05为具有统计学差异.

2结果

2.1ifn?α 2a对细胞生长的 影响 随ifn?α 2a药物浓度的增加，对细胞的抑制率呈增强趋势，当浓度＞1×106 u/l时，对a549细胞的抑制作用最强, 其次是spc?a?1细胞，与对照组比较均有统计学差异（p＜0.05，图1)；对mkn?45，glc?82细胞的抑制与对照组比较无统计学差异.

2.2抑瘤实验经高、低剂量组ifn?α 2a药物 治疗 28～32 d后，干扰素明显抑制a549细胞裸鼠移植瘤的生长，作用呈剂量依赖性，与对照组比较具有统计学差异（p＜0.05），高、低剂量组的最大抑瘤率分别为76.0% 和57.4%；干扰素也可抑制spc?a?1细胞裸鼠移植瘤的生长，与对照组比较具有统计学差异（p＜0.05），高、低剂量组的最大抑瘤率分别为72.6% 和34.4%；高剂量干扰素对mkn?45和glc?82细胞裸鼠移植瘤无明显抑制作用，与对照组比较无统计学差异（图2）.

2.3流式细胞术检测ifn?α 2a受体分布肿瘤细胞表面ifnar的表达具有明显差异，a549细胞表面表达较高, 其次为spc?a?1，mkn?45，glc?82. 表达率分别为（53.5±5.8）%， （43.6±4.4）%，（3.7±0.6）%，（2.0±0.2）%.

2.4荷瘤小鼠肿瘤组织的免疫组化接种a549细胞株的荷瘤小鼠肿瘤组织细胞可见明显的ifnar膜表达；接种spc?a?1细胞株的表达略少于a549；接种mkn?45，glc?82细胞株的几乎没有ifnar表达（图3）.

2.5体外检测4种细胞ifnar蛋白的表达差异以β?actin为内参照，4种细胞的ifnar蛋白水平的表达与以上实验结果一致，从a549到glc?82，ifnar的表达量依次降低（图4）.

3讨论

干扰素α 2a 被批准用于抗肿瘤治疗20多年来已显示有效的抗肿瘤作用, 对毛细胞白血病、慢性髓样白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、胃肠道肿瘤、恶性黑色素瘤等多种肿瘤具有良好疗效［3］. 但也有许多肿瘤对干扰素的治疗并不敏感，如253j b?v ifn（r）(膀胱癌细胞)、mm96（黑色素瘤细胞）、km12l4 ifn(r)(结肠癌细胞)等就属于干扰素抗性肿瘤细胞［2］. 所以发现影响肿瘤对干扰素治疗敏感性的关键分子，就能通过及时检测患者的肿瘤组织细胞是否高表达这一分子而判断该肿瘤是否属于干扰素敏感肿瘤，从而有针对性地进行治疗，减少用药的盲目性，增加患者的生存率或改善生存质量［4］.

大量 研究 显示干扰素在体内发挥效应主要存在两条途径，一是通过激活体内的t细胞、nk细胞等免疫细胞去攻击肿瘤，二是直接作用于肿瘤细胞. 目前 对后者的关注较多，kerr等［5］发现ifn?α通过isgf3与干扰素激活的反应原件（isre）相互作用，引发一系列干扰素敏感基因的转录，如2′?5′腺苷酸合成酶（oas），mx蛋白等，抑制胞内病毒蛋白的合成，从而抑制细胞的增殖；也有报道称［6-7］，干扰素的jak?stat信号通路中激活的stat蛋白家族可作为肿瘤抑制因子抑制肿瘤 发展 ；还有研究认为干扰素的抗肿瘤效应与p53蛋白相关［8］. 而任何一条途径都首先需要ifn?α与其受体ifnar的结合，我们的实验正显示了对干扰素不同敏感性的肿瘤细胞表面ifnar的表达是不同的.

我们发现从细胞水平和动物整体水平筛选出的干扰素敏感和抗性细胞株，其ifnar在mrna水平、蛋白水平和细胞水平的表达也是不同的，且随肿瘤敏感性的下降，受体的表达量依次减少. 初步证实肿瘤对干扰素治疗的敏感性与其细胞表面受体的表达是密切相关的. 当然，治疗敏感性除受体因素外，还存在很多其他影响因素，如实体瘤和血液肿瘤本身与药物接触效率的不同，不同细胞的干扰素受体与干扰素结合的亲和力不同，或者干扰素与受体结合后，通过信号通路激活的下游效应分子不同，对导致肿瘤细胞的凋亡和抑制细胞增殖的作用也是不同的. 所以我们还要对其分子机制进行更进一步的研究，为肿瘤治疗和实现个体化用药提供更准确的证据.

致谢：第四军医大学病 理学 教研室惠延平教授在实验中给予了大力帮助！

【 参考 文献 】

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