桃小食心虫滞育过程中5种代谢酶活力变化
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摘 要：为明确桃小食心虫越冬适应机制，室内利用试剂盒测定了不同滞育时间桃小食心虫滞育幼虫的海藻糖酶、山梨醇脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸激酶和碱性磷酸酶的活力。结果表明，不同滞育时间桃小食心虫体内海藻糖酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸激酶活力差异显著，而山梨醇脱氢酶活力差异不显著。海藻糖酶活力在滞育初期最高，而后随着滞育时间的延长逐渐降低;己糖激酶活力在滞育初期较低，在滞育后期先迅速升高再迅速下降;丙酮酸激酶在滞育中期活力最高，而碱性磷酸激酶活力在滞育初期最高。这表明桃小食心虫在滞育过程中通过代谢酶的调节，提高其越冬期间的抗寒能力，保证顺利越冬。
关键词：桃小食心虫;越冬;滞育;代谢酶
中图分类号：S436.621.2+9 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）06-0097-04
Activity Changes of Five Metabolic Enzymes in
Carposina sasakii Matsumura during Diapause
Zhang Shunyi1，2， Qin Huawei2， Ren Fengshan2， Liu Tingli2，
Chen Zhenzhen1， Men Xingyuan2， Yu Yi2， Xu Yongyu1*， Li Lili2*
（1. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China;2. Institute of Plant Protection，
Shandong Academy of Agricultural Sciences/ Key Laboratory for Plant Virology of Shandong， Jinan 250100， China）
Abstract To clarify the physiological adaptation mechanisms of overwintering， the activities of 5 metabolic enzymes， including trehalase， sorbitol dehydrogenase， hexokinase， pyruvate kinase and alkaline phosphatase， of diapause larvae of Carposina sasakii Matsumura during different diapause time were measured in laboratory by kit. The results showed that the activities of trehalase， hexokinase， pyruvate kinase， alkaline phosphatase had significant differences between different diapause time， while those of sorbitol dehydrogenase had no significant difference. The trehalase activity was the highest in early diapause， then gradually decreased with the prolongation of diapauses duration. The hexokinase activity was lower in early diapause， then increased rapidly and decreased rapidly in later diapause. The pyruvate kinase activity reached the highest level in mid-diapause. The highest activity of alkaline phosphatase appeared in early diapause. These indicated that Carposina sasakii Matsumura improved their cold tolerance by regulating metabolic enzymes during diapause to ensure overwintering smoothly.
Key words Carposina sasakii; Overwintering; Diapause; Metabolic enzyme
昆虫属于变温动物，其体温随着环境温度的变化而进行相应的变化。低温是影响昆虫越冬的重要环境因素。在长期的适应性进化中，昆虫获得了一系列的耐寒策略：越冬前期积累糖原和脂肪，越冬期主要积累海藻糖、葡萄糖、甘油、山梨醇和脂肪等抗冻保护剂。抗冻保护剂有稳定细胞膜结构、保护蛋白的功能，并能通过溶质效应降低昆虫体内过冷却点和结冰点，从而提高昆虫抗寒能力，使昆虫度过严寒的冬季[1，2]。这些抗冻保护性物质则是昆虫在低温条件下，通过诱导和调节体内一系列中间代谢酶来合成的[3]。因此了解越冬过程中参与抗冻保护性物质合成的中间代谢酶活性的变化，对于进一步阐明越冬幼虫的生理生化机制具有重要作用。
桃小食心虫（Carposina sasakii Matsumura）属于鳞翅目（Lepidoptera）蛀果蛾科（Carposinidae），是我国北方果树生产中危害最大、发生面积最普遍的食心虫类害虫[4]。桃小食心虫以老熟幼虫滞育越冬，在滞育期间生长发育几乎处于停滞状态，但是体内仍然进行着一系列复杂的生理生化反应[5]。目前关于桃小食心虫滞育期间生理生化的研究主要集中在滞育期间蛋白、总糖、糖原、海藻糖、甘油、山梨醇和脂肪等抗冻性保护剂的变化上[2，5，6]，但这些物质变化的机理不明，参与抗冻保护性物质合成的中间代谢酶的研究未见报道。因此本研究选取了昆虫滞育期间起关键作用的海藻糖酶（trehalase）、山梨醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase）、己糖激酶（hexokinase）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）5种中间代谢酶进行活力测定，以期为更深入研究桃小食心虫越冬机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试虫为2013年10月采自山东省青州和莱芜的山楂自然脱果的桃小食心虫老熟幼虫，带回实验室后放入消毒的沙子中自然做茧，挑取健康虫茧放入盛有锯末（湿度为12%）的花盆中（锯末、花盆经过高温干燥鼓风烘箱120℃灭菌24 h），花盆表层用保鲜膜覆盖并封好，放置于4℃恒温冰箱中保存待用。从冷藏第20 d开始取样，之后每隔20 d取一次样，每次取出40～50头健康虫茧置于-20℃冰箱中冷冻待用，共取样7次。
1.2 方法
1.2.1 酶液的提取 海藻糖酶、山梨醇脱氢酶和碱性磷酸酶的提取方法相同：取桃小食心虫试虫4～6只，放入预冷的玻璃匀浆器中，加入2 mL提取液，冰水浴中充分匀浆后在4℃条件下2 500 r/min离心10 min，所得上清液即为酶液。每处理重复3次。
己糖激酶和丙酮酸激酶的提取方法相同：取桃小食心虫试虫4～6只，准确称重后放入预冷的玻璃匀浆器中，按质量体积比1∶9的比例加入0.9%的生理盐水，冰水浴中充分匀浆后在4℃条件下2 500 r/min离心10 min，所得上清液即为酶液。每处理重复3次。
1.2.2 酶蛋白浓度的测定 使用牛血清蛋白作为标准蛋白，用考马斯亮蓝G-250染色法进行可溶性蛋白质浓度的测定，具体方法参见天根生化科技（北京）有限公司的试剂盒说明书。
1.2.3 酶活性的测定及计算 5种酶活性的测定及计算均根据南京建成生物技术研究所的试剂盒说明书进行。
1.3 数据处理
用软件SPSS 18.0进行单因素方差分析。试验所获数据以平均值±标准误来表示，采用Tukey法进行差异显著性检验。用Microsoft Excel 2010绘图。
2 结果与分析
2.1 海藻糖酶的活力变化
由图1可以看出，桃小食心虫老熟幼虫体内海藻糖酶的活力在滞育20 d时达最高值36.19 U/g prot.，且随着滞育时间的延长呈显著下降趋势（F=109.94， P<0.05）;滞育60 d时海藻糖酶活力为25.82 U/g prot.，为滞育20 d时海藻糖酶活力的71.35%;滞育80 d后的海藻糖酶活力一直维持在较低水平。
注：图中各数据均为平均值±标准误，不同小写字母
表示在0.05水平下差异显著，下同。
图1 4℃条件下滞育的桃小食心虫
幼虫体内海藻糖酶活力变化
2.2 山梨醇脱氢酶的活力变化
图2结果显示，桃小食心虫老熟幼虫体内山梨醇脱氢酶活力在滞育80 d时达最高值19.61 U/g prot.，较滞育20 d时15.41 U/g prot.，增加27.26%。整个滞育期间，山梨醇脱氢酶活力维持在15.41～19.68 U/g prot.，虽有波动但处理间差异不显著（F=2.57，P>0.05）。
图2 4℃条件下滞育桃小食心虫幼虫
体内山梨醇脱氢酶活力变化
2.3 己糖激酶的活力变化
图3结果显示，桃小食心虫老熟幼虫体内己糖激酶活力在滞育80 d以前维持在较低水平，而后呈显著上升趋势（F=63.27， P<0.05），滞育120 d时达最高值43.60 U/g prot.，较滞育20 d时的11.62 U/g prot.增加2.75倍。随着滞育时间延长己糖激酶活力显著下降（P<0.05），滞育140 d时降至12.57 U/g prot.，较滞育120 d时下降71.17%。
图3 4℃条件下滞育的桃小食心虫幼虫
体内己糖激酶活力变化
2.4 丙酮酸激酶的活力变化
图4结果显示，桃小食心虫老熟幼虫体内丙酮酸激酶活力滞育初期呈显著上升趋势（F=29.91， P<0.05），滞育60 d时达最高值33.24 U/g prot.，较滞育20 d的14.58 U/g prot.增加1.28倍。随着滞育时间延长，丙酮酸激酶活力呈下降趋势，滞育120 d时降至14.94 U/g prot.，随后有小幅回升。
图4 4℃条件下滞育桃小食心虫幼虫
体内丙酮酸激酶活力变化
2.5 碱性磷酸酶的活力变化
图5结果显示，桃小食心虫老熟幼虫体内碱性磷酸酶活力在滞育20 d时达最高值242.62 U/L，且随着滞育时间的延长呈显著下降趋势（F=196.05， P<0.05），滞育60 d时降至最低值43.19 U/L，然后一直维持在较低的水平。
图5 4℃条件下滞育桃小食心虫
幼虫体内碱性磷酸酶活力变化
3 讨论与结论
3.1 海藻糖酶的活力变化
海藻糖不仅是昆虫生长发育必须的能量物质，而且是低温条件下保护昆虫生命过程和生物特征的抗冻保护剂[7，8]。海藻糖酶是一种催化海藻糖水解的酶，可以将1分子的海藻糖水解成2分子的葡萄糖[9，10]。本试验中桃小食心虫滞育幼虫体内海藻糖酶活力随处理时间的延长逐渐下降，从而使海藻糖含量在滞育过程中维持在较高水平，提高桃小食心虫抗逆能力，促使其顺利越冬，这与麦红吸浆虫、梨小食心虫、家蚕的海藻糖酶活性变化相一致[11～13]。且该结果与丁惠梅[2]的试验结果相吻合，桃小食心虫在滞育过程中通过积累海藻糖提高抗逆能力。
3.2 山梨醇脱氢酶的活力变化
近年来一些研究发现，山梨醇脱氢酶在昆虫滞育以及滞育解除过程中均起着重要作用。在昆虫滞育期间，山梨醇能够保护昆虫免受低温冻伤[14]，因此昆虫滞育解除时，山梨醇脱氢酶必不可少，并且含量有所上升[15]。本试验中，山梨醇脱氢酶活力变化总体比较平稳，一直维持在较低水平，说明桃小食心虫在滞育期间积累山梨醇。
3.3 己糖激酶和丙酮酸激酶的活力变化
己糖激酶和丙酮酸激酶都是糖酵解途径的关键酶，其中己糖激酶是一个由单糖（六碳糖）进入糖酵解途径的酶，也是越冬后期海藻糖的分解产物――葡萄糖转化为其它代谢能源的一个关键酶[3]，丙酮酸激酶能催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸[16]。桃小食心虫在滞育初期，己糖激酶的活力较低，说明己糖的酵解较少;丙酮酸激酶含量逐渐升高，说明糖原酵解正在加强，桃小食心虫在滞育期间不积累糖原，这与王鹏等[5]的研究结果一致。桃小食心虫在滞育80～120 d时己糖激酶的活力迅速升高，说明此时桃小食心虫通过酵解单糖为其生命活动提供能量;丙酮酸激酶的活力迅速下降，说明此时糖原的酵解正在减弱。而后己糖激酶和丙酮酸激酶的活力降低，说明糖酵解减弱，生命活动维持在较低水平，从而提高其耐寒性。
3.4 碱性磷酸酶的活力变化
碱性磷酸酶是一类非特异性磷酸水解酶，能催化磷酸单酯的水解及磷酸基团的转移反应，是生物代谢过程中重要的调控酶[17]。碱性磷酸酶对昆虫滞育时间有一定的调控作用[18]。酶活力的稳定性对于生物代谢的稳定性至关重要，酶活力越稳定，生物代谢就越稳定，生物适应能力就越强[19]。本试验中桃小食心虫体内碱性磷酸酶活性在滞育20～60 d时迅速下降，而后在较低水平上下波动，说明桃小食心虫在滞育过程中代谢活动逐渐减弱，然后维持在较低水平，从而降低体内营养物质消耗，使桃小食心虫顺利度过严寒的冬季，这与何超等[12]的研究结果相似。
试验结果表明桃小食心虫滞育期间体内依然进行着一系列复杂的代谢，与桃小食心虫滞育有关的代谢酶（海藻糖酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶）活力发生了显著变化。桃小食心虫通过对相关酶类的调控，使其在越冬期间体内的物质和能量代谢得到调节，提高了桃小食心虫抵御外界不良环境条件的能力，从而顺利越冬。
参 考 文 献：
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