黄芩苷对猪细小病毒体外作用
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《中兽医医药杂志》2015年第三期
1材料与方法
1.1黄芩苷的提取
1.1.1煎煮法称取黄芩生药50.0g，分别加水10、8倍量，煎煮2次，每次1h，过滤,合并2次滤液，备用。
1.1.2回流法称取黄芩生药50.0g，取65%的乙醇800mL，将黄芩置入乙醇内进行水浴回流，每次2h，连续2次，过滤，合并2次滤液，备用。
1.1.3渗漉法称取黄芩生药50.0g，先用适量65%的乙醇溶液浸润过夜，再将浸润后的黄芩生药装入洗静的渗滤筒中，加入浓度为60%乙醇溶液1500mL，渗漉，速度2-3mL/min。收集渗漉液，备用。
1.1.4黄芩苷的提取将以上3种方法得到的滤液或渗漉液均分成2等份。取第1份滤液，加入2mol/L的浓盐酸，调节pH值至1-2，搅匀，70℃保温1h，静置24h，除去上清液，沉淀物中加水50mL，充分搅拌，加入40%NaOH溶液调节pH值至6-7，溶解沉淀。加入95%乙醇使含醇量达50%，50℃加热，过滤。滤液仍用2mol/LHCl调节pH值至1-2，70℃保温1h，静置，使黄芩苷沉淀完全析出，真空抽滤，沉淀物用蒸馏水漂洗至中性，60℃干燥，得黄芩苷粗品。将粗品溶于70%乙醇溶液，在278nm处测定吸光度A，将A带入回归方程，计算粗品中黄芩苷含量和黄芩苷收率（黄芩苷收率=黄芩苷粗品质量×黄芩苷含量/黄芩饮片×100%）。取第2份滤液水浴浓缩蒸干，放入105℃干燥箱中干燥至恒重，得浸膏。
1.1.5酸沉碱溶法提取黄芩苷（粗品）精密称取黄芩饮片250g，分别加10、8倍量水浸泡、煎煮2次，每次1h，过滤，合并2次滤液，加热浓缩至500mL，加2mol/LHCl，调pH值至1-2，70℃保温30min，2000r/min离心10min，弃去上清液。取1000mL蒸馏水加至沉淀物中，搅匀，然后加入40%NaOH溶液调节pH值至7，并加入等量95%的乙醇，搅拌，使沉淀物溶解，过滤后弃去杂质。滤液再用2mol/LHCl调节pH值至1-2，70℃保温30min，静置12h，过滤取沉淀，用蒸馏水反复洗涤至中性，真空抽滤，置80℃温箱中干燥，称重，得黄芩苷粗品1.047g。
1.2黄芩苷粗品对PK-15细胞的无毒浓度测定取1.0×105个/mL浓度的PK-15细胞，加至灭菌96孔细胞培养板上，100μL/孔。待细胞长成单层，加入用含10%标准牛血清的DMEM营养液倍比稀释的黄芩苷悬液，置5%浓度的CO2培养箱内于37℃培养72h。每天观察记录细胞变化和CPE，并设细胞对照组。
1.3不同浓度黄芩苷对PPV的阻断作用用含5％标准新生牛血清的DMEM维持液对无毒浓度的黄芩苷依次做2倍倍比稀释，共设9个稀释度，然后加到已长成PK-15细胞单层的96孔细胞培养板上，100μL/孔，每个稀释度设4孔重复。将96孔板置5％浓度的CO2培养箱中培养4h，取出，弃去上清液，每孔加入100μL的100TCID50浓度的PPV。设病毒对照和细胞对照组。每天观察细胞变化情况，当病毒对照组细胞病变达到75%以上时，记录各组细胞病变情况。
1.4不同浓度黄芩苷对PPV的抑制作用在PK-15细胞长成单层的96孔细胞培养板上加入100TCID50浓度的PPV，100μL/孔，5％CO2培养箱中培养4h，再用含5％标准新生牛血清的DMEM维持液将无毒浓度的黄芩苷依次做2倍稀释，共9个稀释度，每稀释度重复4孔，100μL/孔，加到已加入PPV的96细胞培养板上，5％CO2培养箱中培养，并设病毒对照和细胞对照组，每天观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达到75%以上时，记录各组细胞病变情况。
1.5CPE判定标准“-”为正常无病变细胞；“+”为视野中出现25%的细胞病变；“++”为视野中出现50%的细胞病变；“+++”为视野中出现75%的细胞病变；“++++”为视野中出现100%的细胞病变。
2结果
2.1不同提取方法所得黄芩苷浸膏质量和收率比较实验结果见表1。从表1可知，3种不同提取方法所得黄芩苷浸膏质量分别为每10g生药3.13g、3.62g、3.71g，经t检验无显著性差异，表明浸膏提取率相似。但3种方法的黄芩苷收率不同，回流法收率最高，达7.27%。
2.2不同提取方法所得黄芩苷粗品质量和含量比较由表1可知，3种不同提取方法中，回流法所得的黄芩苷粗品质量为每10g生药0.811g，所获得的粗品最多，与渗漉法、煎煮法有显著性差异（P<0.05），后两者之间差异不显著。3种提取方法中，回流法所得到的黄芩苷粗品质量、含量及收率均为最高。
2.3.1PPV的TCID50测定结果PPV接种PK-15细胞96h后，计算PPV的TCID50为10-4.75/0.1mL。
2.3.2黄芩苷对PK-15细胞无毒浓度测定结果以黄芩苷对PK-15生长无影响的最大稀释浓度作为安全浓度。培养96h后，根据PK-15细胞的生长情况，测得黄芩苷的安全浓度为11.75μg/mL（稀释倍数为4×103）。
2.3.3细胞培养与细胞病变（CPE）加入到96孔细胞培养板上的PK-15传代细胞可在24-36h内长成致密的单层，显微镜下观察发现细胞呈多角形、圆形等形态，不同细胞间轮廓清晰。接种PPV培养96-120h后，镜检发现PK-15细胞轮廓逐渐模糊，细胞团缩、聚集成堆、变圆、脱落。
2.3.4黄芩苷对PPV的阻断作用取无毒浓度范围内的黄芩苷连续做2倍倍比稀释，加入到PK-15单层细胞中，作用4h后再加入PPV，观察细胞的生长情况，结果见表2。由表2可知，黄芩苷加至PK-15单层细胞后，可对PPV起到显著的阻断作用，且阻断效应与黄芩苷的浓度梯度呈正相关。黄芩对PPV所致CPE最小阻断浓度为0.0918μg/mL。
2.3.5黄芩苷对PPV的抑制作用先在单层PK-15细胞上接种PPV，病毒和细胞作用4h后，再加入不同稀释浓度的黄芩苷，观察细胞生长情况，其结果见表3。由表3可知，加入黄芩苷后，对PPV引起的细胞病变有一定的抑制作用，抑制效应与黄芩苷的浓度梯度呈正相关。黄芩苷对PPV所致CPE最小抑制浓度为0.367μg/mL。
3讨论
3.1黄芩苷提取
3.1.1煎煮法、回流法、渗漉法三种提取黄芩苷的方法，结果差异较大，其中回流法的收率最高，煎煮法和渗漉法较低。分析其原因，与所用提取溶剂和温度有关。煎煮法所用溶剂为水，回流法和渗漉法所用溶剂为65%乙醇，乙醇溶解黄芩苷的能力比水强，因此煎煮法产率最低。渗漉法和回流法虽然均用乙醇作为溶剂，但回流法采用加热，高温易于黄芩苷的溶出，渗漉法却只靠浓度差溶出黄芩苷，得率较低。煎煮法为中药成分提取最常用方法，简便易行，不需要特别装置，故常以煎煮法为对照，采用t检验评价黄芩苷不同提取方法的优劣。
3.1.2黄芩苷粗品在干燥过程中，干燥箱温度不宜过高，否则会影响产品效力，并使药物颜色、性状等发生改变。
3.1.3使用紫外可见分光光度计测量时，吸光度值应控制在0.2-0.8，否则各个数据不呈线性关系，从而影响测定结果。
3.2黄芩苷对猪细小病毒体外作用实验测得黄芩苷对PK-15细胞的最大安全浓度为0.01175mg/mL。在安全浓度范围内设计2组实验，第1组先将黄芩苷加到细胞中作用一段时间，再接种病毒，观察黄芩苷对病毒的阻断作用，即预防作用；第2组先将病毒接种于细胞作用一段时间，再加入黄芩苷，观察药物对病毒的抑制作用，即治疗作用。结果表明，黄芩苷对PPV最小阻断浓度为0.0918μg/mL，对PPV的最小抑制浓度为0.367μg/mL，说明黄芩苷在体外对PPV有明显的阻断和抑制作用。黄芩苷对PPV的阻断浓度比抑制浓度小2个梯度，即阻断作用是抑制作用的4倍，说明黄芩苷可有效预防PPV感染。
在测定黄芩苷体外对PPV的抑制作用中采用CPE观察法，操作方法简单、结果判定直观，但容易受细胞培养板、培养时间、试验条件、操作因素等的影响，试验的稳定性及重复性有待于进一步提高。
作者：陈功义 郝振芳 王建超 单位：河南农业职业学院 河南省新密市原庄乡初级中学