药饵对明对虾酶活性的影响

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药物在生物体内的转化主要是通过药物代谢酶起作用, 细胞色素 P450(cytochrome P450, CYP450)和谷胱甘肽-S-转移酶(gultathione-S-transferases,GST)是药物转化过程中的两个重要代谢酶系[1]。CYP450 作为药物代谢 I 相酶对药物分子进行官能团化反应, GST 是药物代谢 II 相反应中一类重要的药物代谢转移酶, 可催化谷胱甘肽(GSH)与亲电中间代谢物的结合, 清除脂类过氧化物, 从而解除内源性或外源性毒物的毒性, 在解毒系统中起重要作用[2]。以往的研究表明, 海洋动物体内CYP450 和 GST 活性可以受到多种外源物质的影响, 包括重金属离子[3]、原油[4]、有机物[5]等。中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)是中国重要的出口水产品, 其在 2010 年养殖产量已达到 4.53 万 t, 为中国水产养殖业带来较大的经济效益。而自 1993 年对虾白斑综合征病毒(white spotsyndrome virus, WSSV)流行以来, 中国明对虾养殖产业就一直受到病害频发的困扰[6]。药物防治作为主要的疾病防治手段之一, 被广泛应用于中国水产养殖业。诺氟沙星(Norfloxacin, NFLX)是喹诺酮类抗菌药物, 具有抗菌作用强、抗菌谱广、生物利用度高等特点, 在中国经济鱼类、对虾病害防治过程中起到了积极作用[7]。中国学者围绕水产药物对养殖动物药物代谢酶的影响进行了相关研究, 涉及的药物包括氟苯尼考[8]、乙醇[9]、氟甲喹和恩诺沙星[10]、加替沙星和环丙沙星[11 12]、黄芩苷等[1], 研究物种包括中国明对虾[1]、鲫(Carassius auratus)[8]、牙鲆(Para-lichthys olivaceus)[10]、大鼠(Rattus norvegicus)[11]、猪(Sus scrofa)[12]等。而有关喹诺酮类药物对海洋甲壳动物药物代谢酶方面的研究则较少。同一种外源物质对不同物种药物代谢酶的作用并不完全一致[13], 药物代谢酶的诱导或抑制可改变药物代谢和血药浓度, 并影响药效和毒性, 是导致药物不良反应的重要原因。许多药动学特征, 如药物半衰期、肝脏首过效应、药物相互作用、清除率和生物利用度及药物残留等, 均与细胞色素 P450有关[14]。研究药物与生物体药物代谢酶的相互作用, 对于保证临床合理给药, 避免药物不良反应和实施个体化给药方案, 以及在药物残留研究方面都具有重要价值, 因此研究水产常用药物对中国明对虾药物代谢酶的影响, 对于药物的合理使用、科学联合用药及控制药物残留具有重要意义。本研究采用药饵给药的方法, 研究了不同浓度诺氟沙星对中国明对虾鳃和血清药物代谢 I 相酶[7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶(7-ethoxycoumarinO-Deethylase, ECOD) 、氨基比林 -N- 脱甲基酶(aminopyrine-N-demethylase, APND)]和 II 相酶(谷胱甘肽-S-转移酶, GST)活性的影响, 以期探讨上述酶类对诺氟沙星作用的响应及其在中国明对虾诺氟沙星代谢过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用中国明对虾体质量(5.8±0.4) g, 购自山东省青岛市胶州宝荣水产公司, 于实验条件下暂养 10 d, 期间每天换水 1 次, 连续充气, 水温(22.0±1.0)℃, 盐度(25.1±0.7), pH 8.1±0.6, 每天早晚各投喂对虾配合饲料 1 次, 每次投喂量为对虾体质量的 1%。对虾配合饲料购自青岛长生中科水产饲料有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 药品及试剂

诺氟沙星购自武汉刚正生物科技有限公司, 纯度 99%以上; 氨基比林、1-苯基-2-硫脲(1-phenyl-2-thiourea, PTU, 98%)、7-羟基-3-异吩恶唑酮(Resorufin, RF)、7-乙氧基-3-异吩恶唑酮(Ethoxyresorufin, ERF)购自 Sigma 公司; 乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)购自 Amresco 公司。

1.2.2 实验设计

实验动物选择健康的中国明对虾, 设 1 个对照组和 3 个实验组(高、中、低剂量组), 每组对虾 100 尾。每个实验组对虾分别养在200 L 白色塑料桶中, 每桶 20 只。饲料配制及药物添加: 基础饲料中添加 2%的玉米油, 使用 2%褐藻酸钠作为黏合剂, 成形后喷 2% CaCl2溶液钙化。按照每天每千克虾体质量摄食量 20 g 计算, 诺氟沙星药粉分别按照 60mg/kg(高剂量组, HD)、30 mg/kg(中剂量组, MD)和 15 mg/kg(低剂量组, LD)的给药剂量添加。投喂及取样: 实验前 1 d 停止投喂配合饲料,试验组分别投喂含不同浓度诺氟沙星药粉的饲料,空白对照组(CK)投喂不含诺氟沙星药粉的基础饲料, 每天早晚各投喂 1 次, 每次投饵量为对虾体质量的 1%, 连续投喂 7 d。分别于最后 1 次投喂药饵后的 1、2、4、6、8、12、24、48 h 随机取对虾 8 尾, 使用一次性注射器于对虾第一腹节处抽取血淋巴, 与抗凝血剂(配方参照文献[15])按照 1∶1 比例混合后离心(4 ℃, 4 500 g, 10 min),取上清保存于 70℃冰箱直至分析, 鳃组织样品取出后置于液氮保存直至分析。

1.2.3 样品处理

S9 制备: 鳃 S9(9 000 g super-natant)的制备参照韩华等[10]的方法进行。用预冷的 PBS(pH7.4)缓冲液反复冲洗鳃组织样品, 液氮研磨至粉状, 按 1∶5(W/V)的比例加入预冷的匀浆缓冲液(0.1 mol/L pH7.5 PBS, 含 1 mmol/LNa2EDTA, 1 mmol/L PMSF, 1 mmol/L PTU, 0.1mmol/L DTT, 15%甘油), 4℃放置 10 min 后离心(4℃,13 500 g, 25 min), 上清液用两层已被 PBS 缓冲液润湿过的纱布过滤, 将漂浮的脂类物质除去, 即制成 S9 部分, 分装于离心管中, 置于 70℃冰箱中保存备用。

1.2.4 对虾药物代谢酶活性测定

APND 活性测定参照 Schenkman 等[16]的方法进行; ECOD 活性测定参照文献[17]进行; GST 活性及总蛋白含量测定使用试剂盒(南京建成生物研究所)完成, 具体方法参照试剂盒说明书, 通过检测 GSH 浓度的高低来反应 GST 活力的大小。

1.2.5 统计与分析

采用 SPSS 13.0 统计软件进行单因素方差分析(ANOVA), 用 Duncan’s 法对均值进行多重比较。所得数据为 3 个平行样数据的平均值±标准差( x ± SD)。差异显著度为 0.05。

2 结果与分析

2.1 投喂不同剂量诺氟沙星的中国明对虾鳃和血清的 GST 酶活性

由图 1 可知, 3 个剂量诺氟沙星对中国明对虾鳃和血清 GST 活性整体呈现抑制作用。LD 组和MD 组鳃 GST 活性随取样时间呈现先下降后上升的趋势, LD 组和 MD 组鳃 GST 活性分别在 6 h 和4 h 达到最低, 分别是 CK 组的 20.05%和 8.87%;HD 组鳃 GST 活性在 24 h 高于 CK 组(P<0.05), 12h 和 48 h 与 CK 组没有显著差异(P>0.05), 其他各时间点均显著低于 CK 组(P<0.05), 其中 2 h 时活性最低。LD 组和 MD 组血清 GST 活性分别从 6 h和 4 h 开始即显著低于 CK 组(P<0.05), 且分别在24 h 和 48 h 达到最低值; HD 组血清 GST 活性则在各时间点均显著低于 CK 组(P<0.05)。

2.2 投喂不同剂量诺氟沙星的中国明对虾鳃和血清 APND 酶活性

诺氟沙星对中国明对虾鳃和血清 APND 活性均呈现抑制作用, 且存在一定的时间和剂量效应。随着诺氟沙星浓度的升高, 鳃和血清 APND活性受到抑制的作用愈加明显, 且 APND 活性均呈现先降低后上升的趋势(表 1)。除 LD 组鳃 APND活性在 2 h 和 48 h 与 CK 组没有显著差异外(P>0.05), 其余各剂量组在各取样时间点 APND 活性亦均显著低于 CK 组(P<0.05)。其中 12 h MD 组鳃APND 活性最低, 为 3.17 mol/[min?mg(prot)], 为CK 组的 65.09%; HD 组 APND 活性在 4 h 时达到最低, 为3.32 mol/[min?mg(prot)], 是CK的63.48%。在取样的各个时间点, 3 个剂量诺氟沙星对中国明对虾血清 APND 活性均呈现显著抑制作用(P<0.05)。其中在 8 h 时, LD、MD 和 HD 组 APND活性均达到最低, 分别为 1.66、1.24 和 1.12mol/(min?mL), 为 CK 组的 64.59%、 48.25%和43.58%。3 个浓度组血清 APND 活性随取样时间均呈现先下降后上升的趋势。

2.3 投喂不同剂量诺氟沙星的中国明对虾鳃和血清 ECOD 酶活性

由表 2 可知, 各剂量诺氟沙星对中国明对虾鳃和血清 ECOD 活性整体呈现抑制作用。其中MD 和 HD 组鳃 ECOD 活性在取样的整个过程中均显著低于 CK 组(P<0.05); LD 组鳃 ECOD 活性则在 1 24 h 显著低于 CK 组。在取样各时间点, 3个浓度诺氟沙星对中国明对虾血清 ECOD 活性均呈现显著抑制作用(P<0.05), 且酶活性均呈现先下降后上升的趋势。

3 讨论

3.1 诺氟沙星对中国明对虾鳃和血清 GST 活性的影响

许多研究表明, GST 是一种高诱导性酶, 具有广泛的作用底物, 有机、无机化合物均可诱导其活性。GST 活性作为指标常被用于水环境有毒物质的作用诊断, 其对不同污染物暴露的响应规律有所不同, 其中大多研究集中在鱼类和贝类方面[18 22]。GST 受到抑制后, 一方面可能影响需要经其代谢的外源物质, 另一方面还可能影响机体的解毒功能[23]。研究表明, 生物体 GST 对外源物质的响应与外源物质结构及物种密切相关。有文献报道, 单诺沙星和达氟沙星分别对鲤(Cyprinus carpio L.)[24]和史氏鲟(Acipenser schrenki Brandt,1869)[25]GST活性没有显著影响, 聂湘平等[26 27]则发现环丙沙星可以分别显著诱导异育银鲫(Carassius auratusgibelio)和剑尾鱼(Xiphophorus helleri)GST 活性。诺氟沙星作用下中国明对虾肝和鳃GST活性均受到显著抑制, 这可能是由于给药时间较长, 中国明对虾在诺氟沙星长时间作用下受到了氧化胁迫所致。中国明对虾鳃和血清 GST 活性在诺氟沙星作用下均受到抑制, 但抑制程度不同, 可能是由于 GST 的几种同工酶在鳃和血清中分布不同, 以及药物在两种组织中含量不同有关, 这一现象在大鼠[23]中也有发现。有文献表明, 甲壳动物同高等动物类似, 口服给药时药物先通过胃肠黏膜及毛细血管, 然后进入肝门静脉, 通过肝后才能进入血液循环, 因此血液中药物达峰时间往往要比肝等组织晚[28]。本研究发现, 与鳃相比, 血清 GST 活性较晚受到抑制, 可能与药物达到血淋巴比鳃晚有关。本实验室研究了诺氟沙星在中国明对虾体内的代谢规律, 发现以50 mg/kg剂量给药5 d后, 中国明对虾鳃和血淋巴诺氟沙星含量分别在最后 1次给药的 2 h 和 4 h 达到最高, 其后鳃诺氟沙星浓度逐渐下降, 血淋巴则在 24 h 出现双峰现象[29]。此结果表明中国明对虾鳃GST活性在诺氟沙星作用下呈现一定的时间效应, 其中 LD 和 MD 组在4~8 h GST 活性抑制率较高, MD 和 HD 组血淋巴GST 活性在给药后的 6 h 和 48 h 抑制率较高, 与上述研究中诺氟沙星在中国明对虾体内代谢规律基本一致。本研究并未发现诺氟沙星对中国明对虾鳃和血清 GST 活性的促进作用, 而文献[29]表明,诺氟沙星给药后的 0.5~2 h, 中国明对虾体内诺氟沙星浓度逐渐上升, 推测此时有可能对 GST 活性有促进作用。由于本研究未在该时段设置取样点,从而未能反映该时间段 GST 活性变化情况, 因此不能完全排除中国明对虾GST活性在某一时间段被低浓度诺氟沙星诱导的可能。

3.2 诺氟沙星对中国明对虾肝胰腺 ECOD 和APND 活性的影响

APND 主要反映 CYP2 家族中进行脱甲基化反应的同工酶的活性[30]。关于药物对 APND 活性的影响也进行了相关研究。Li 等[31]的实验研究结果显示, 连续注射 3 d 50 mg/kg 和 80 mg/kg 的利福平后, 草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和黑鲈(Micropterus salmoides)肝微粒体 APND 活性都呈逐渐升高趋势; 且随着浓度的升高呈现先升高后降低的趋势。有研究表明, 氟苯尼考对鲫 CYP2E1活性有显著的抑制作用[8], 喹诺酮类药物对牙鲆(Paralichtys olivaceus)肝 APND 活性也有显著的抑制作用[10]。本研究结果与上述结果一致, 在中国明对虾连续给药诺氟沙星后, 检测到了鳃和血清 APND 酶活性的显著下降, 说明诺氟沙星对中国明对虾鳃和血清 APND 活性具有抑制作用, 且这种抑制作用存在一定的时间和剂量效应, 这可能与给药次数多、时间长, 导致药物在中国明对虾体内的残留时间较长有关。CYP1A 常被作为环境毒理学中的生物标志物, 其中在无脊椎动物中研究较多的是代表CYP1A 亚家族的 ECOD 活性[32]。研究表明,CYP1A1 的活性可以受到多种物质的抑制, 包括细胞因子和氧胁迫(如 H2O2)[33]。由于其结构的特殊性, 抗生素也可能是导致生物体内活性氧含量上升的原因之一[33], 而抗生素对生物体的毒性机制则可能是活性氧含量增加与抗氧化防御下降相结合的结果[34]。本研究发现, 不同浓度诺氟沙星对中国明对虾鳃及血清 ECOD 活性均呈现显著的抑制作用, 且该抑制作用随着诺氟沙星浓度的增加愈加明显, 呈现一定的剂量效应。此结果与先前报道的恩诺沙星对舌齿鲈(Dicentrachus labrax) CYP-1A 家族酶活性的影响结果一致[35]。有文献报道, 氟甲喹对虹鳟(Oncorhynchusmykiss)和异育银鲫(Carassius gibelio)EROD 活性具有诱导作用[34,36], 虽然同为喹诺酮类药物, 但上述研究结果与本研究的结果并不相同, 可能与药物结构及靶向动物不同有关。有学者研究了喹诺酮类药物对P450的抑制机制, 认为可能与喹诺酮类药物的分子组成及空间构象有关。Fuhr 等[37]认为喹诺酮类药物分子中 8 位上没有取代基, 或7 位哌嗪基 3′和 4′上无甲基等取代基, 因而其对P450 酶的抑制作用较强。本实验中诺氟沙星的嗪啉环 8 位和 7 位哌嗪基上均没有取代基[10], 因此其对中国明对虾 APND 和 ECOD 的抑制作用较强。

本研究提示, 诺氟沙星对中国明对虾 GST、APND 和 ECOD 活性呈现显著抑制作用, 且对APND 和 ECOD 的抑制作用具有一定的时间和剂量效应。当诺氟沙星与其他药物合并用药时, 应考虑诺氟沙星对上述 3 种酶的抑制作用, 而导致经其代谢的药物在对虾体内的蓄积和毒性增强。