木薯磷酸酮酸羧化酶基因表现分析

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本文作者:张杨 陈新 卢诚 王文泉 单位：海南大学农学院 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 能源作物分子育种实验室

木薯(ManihotesculentaCrantz)又名树薯、木番薯，是大戟科(Euphorbiaceae)木薯属植物，为世界3大薯类作物之一，全球7亿多人口的食物来源[1]。木薯为适应热带与亚热带气候的淀粉高效累积作物，具有较高的光合产物累积效率与独特的抗逆性等生物学特性[2]。在我国热带地区，木薯是淀粉和酒精加工的主要原料。同时木薯作为一种生物能源和生物材料的原料，将会在应对全球能源与环境危机中发挥重要作用[3]。木薯具有高于一般C3植物的净光合速率(netphotosyntheticrate,Pn,达43μmolCO2m-2s-1)和光合作用最适温度(45℃)[4–5]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase,简称PEPC)是C4植物光合作用途径中的关键酶，在典型C4植物叶肉细胞中表现出很高的活性，它催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO2不可逆地生成草酰乙酸，起到高效固定CO2的作用，最终提高C4植物的光合效率。栽培种木薯叶片中具有类似于C4植物叶片中的较高PEPC活性[6–7]，但野生型木薯则被认为是C3型植物[8]，且野生型叶片中的PEPC活性和净光合效率普遍低于栽培种。目前，对拟南芥(Arabidopsisthaliana)[9]、玉米(Zeamays)[10]、蓖麻(Ricinuscommunis)[11]、高粱(Sorghumvulgare)[12]等和一些C4植物中PEPC的功能都有较深入的研究。近年来利用基因工程技术将C4植物的pepc基因导入水稻(Oryzasativa)等C3植物也取得了一些可喜进展，成为提高C3植物光合效率的新途径[13]。本研究分别从木薯野生种(Manihotesculentasubsp.flabellifolia)W14和栽培种(M.esculenta)Arg7叶片中克隆得到pepc基因全长cDNA，对它们的核苷酸序列及编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析，同时对木薯pepc基因的表达进行了分析，旨在探讨木薯pepc基因的结构与功能在野生种与栽培种间的差异，及其与典型C3和C4植物的同源性关系，为揭示木薯高光效、高淀粉累积机理奠定理论基础。

1材料和方法

1.1材料植物材料

选择木薯栽培种(Manihotesculenta)Arg7和野生种(Manihotesculentasubsp.flabellifolia)W14为材料。Arg7为引自阿根廷的高淀粉种质，块根淀粉率在32%~34%；W14是来自国际热带农业研究中心(CIAT)的木薯野生种，生长较弱，能够结少数块根，块根淀粉率低，只有4%~5%，以种子繁殖为主，茎秆一般没有繁殖再生能力。材料保存于中国热带农业科学院热带生物技术研究所木薯实验种质圃。菌株和质粒

大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α和pMD19-Vector购自TaKaRa公司。试剂

总RNA提取试剂RNAplantplusReagent购自TIANGEN公司，反转录试剂盒RevertAidTMFirstStandcDNASynthesisKit购自Fermentas公司。快速PCR扩增聚合酶SpeedSTARHSDNAPolymerase、限制性内切酶、T4连接酶以及其它工具酶均购自TaKaRa公司。PCR引物由上海生工合成，凝胶回收试剂盒购自OMEGAbio-tek公司。

1.2叶片RNA提取以及cDNA第一条链合成将木薯叶片在液氮中迅速研磨成粉末状,取50~100mg转入1.5mL离心管中,具体步骤按RNAplantplusReagent操作手册进行。提取完毕后取1μLRNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测。cDNA第一链合成按照RevertAidTMFirstStandcDNASynthesisKit反应步骤进行。

1.3pepc基因的克隆引物设计与巢式PCR扩增

以麻疯树(Jatrophacurcas)pepc基因的cDNA全长序列(GenBank序列号为EU069413)为探针，通过Blastn搜索GenBank数据库中的木薯EST数据库，得到与其相似性较高的木薯EST序列。将搜索到的EST序列连同麻疯树pepc基因cDNA全长序列用软件VectorNTISuite11.0中的Assemble进行组装，去掉含有较多碱基差异的EST序列，用VectorNITSuite11.0中的Analysis分析组装后的cDNA序列的开放阅读框，用木薯EST序列拼接出较完整的5′UTR区域和3′UTR区域。根据5′UTR区域和3′UTR区域序列设计两轮巢式PCR引物进行木薯pepc基因全长cDNA序列克隆。巢式引物序列设计

第一轮引物：上游引物为5′-GTATAGCAAAGTAACAGGGC-3′；下游引物为5′-AGCCTTCCATAAATACACAGC-3′。第二轮引物：上游引物为5′-CGCAACACAATCCTAT-GGCT3-3′；下游引物为5′-CCAACGGGAATAAC-ACACATCA-3′。根据快速PCR扩增聚合酶SpeedSTARHSDNAPolymerase手册进行两轮巢式PCR扩增。第一轮PCR扩增产物稀释100倍后，取1μL作为第二轮扩增模板。PCR产物的克隆

利用凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，连接至pMD-19载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素Amp培养基筛选阳性克隆并测序。

1.4核苷酸、氨基酸生物信息学分析蛋白质的基本性质预测等在VectorNTISuite11.0软件上进行，用软件DNAman进行同源性比对，运用NCBI中保守功能域(CDD)搜索程序分析结构功能域，在数据库/prosite/搜索蛋白质Motif。1.5组织特异性表达分析分别采集种植150d后的W14和Arg7的须根、块根、功能叶、茎等组织，并提取RNA。采用TaKaRa公司的One-StepRT-PCRKit试剂盒。pepc基因表达分析引物为pepc-F(5′-CGGAT-CAACGGGAAGCAAGA-3′)和pepc-R(5′-GCAAG-ATGAGTGGGTCCTCC-3′)。内参选择18SrRNA基因，引物为18S-F(5′-ATGATAACACGACGGCT-CGC-3′)和18S-F(5′-CTTGGATGTCGTAGCCGT-TT-3′)；反应中的RNA用分光光度计定量500ng。PCR反应条件为：50℃30min，94℃2min，共25个循环(18S基因)；94℃30s，56℃30s，72℃60s，共28个循环(pepc基因)。1.6叶片中单日动态表达分析在晴朗天气，从早8∶00至下午18∶00每隔2h采样一次，共6次分别采集种植150d后的W14和Arg7顶部完全展开叶(共12份样)，并提取RNA。采用购自Fermentas公司的FirstStrandcDNASynthesisKit(K1621)试剂盒合成第一链cDNA，采用购自TaKaRa公司的SYBRPremixExTaqTM实时定量PCR试剂盒(DRR041)进行定量分析。所用实时定量PCR仪为Rotor-Gene6000。pepc基因日动态表达分析引物与组织特异性表达分析引物相同。内参选择木薯Actin基因，引物为Action-F(5′-CGATGGTCGTACAACTGGTAT-3′)和Actin-R(5′-ATCCTCCAATCCAGACACTGT-3′)。PCR反应条件：95℃10s，95℃5s，56℃15s，72℃15s，共40个循环。采用2–CT法计算相对表达量，CT值即循环阈值，表示每一个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。将原始CT值用Rotor-Gene6000软件1.7版本的CT法转换成相对表达量，相对表达量=2–CT,CT=(CT待测样–CT对照),CT=CTpepc–CTActin。

2结果和分析

2.1pepc基因cDNA的克隆利用RNAplantplusReagent获得较完整的W14与Arg7叶片总RNA，其OD260/OD280为1.93,电泳显示28SrRNA和18SrRNA都比较清晰明亮，RNA完整性较好。第一轮巢式PCR扩增没有出现特异条带。分别将W14和Arg7第一轮巢式PCR产物稀释100倍后，取1μL作为第二轮巢式PCR的模板进行扩增。结果在第二轮PCR扩增中均出现一条特异的亮带，大小约为3000bp，与预测的长度基本一致，分别回收得到的条带并克隆到pMD19-Vector后测序。

2.2PCR扩增片段测序与分析通过比较多个测序结果(W14和Arg7各回收6个克隆)，证明来自W14和Arg7的片段长度均为2945bp，应用VectorNTISuite11.0的AlignX与其它物种进行比对,表明该片段是木薯pepc基因的cDN段。应用VectorNTISuite11.0中findORF分析，说明W14与Arg7的pepccDNA序列均包括1个2895bp的开放阅读框，在起始密码子前还有个18bp的序列，证明获得的是木薯W14与Arg7的pepc基因的全长cDNA序列。将获得的两个木薯pepc基因cDNA序列在GenBank中登录，Arg7和W14的pepc基因cDNA序列号分别为JN387052和JN387053。

2.3木薯pepc基因编码的蛋白质特性及功能位点、结构功能域确定通过VectorNTISuite11.0软件推测出W14和Arg7的pepc基因编码的PEPC均含964个氨基酸，通过DNAman比对表明，W14和Arg7的PEPC氨基酸序列同源性高达99%，仅存在10个不连续的氨基酸差异。利用ExPASy的ProtParam预测W14和Arg7的PEPC分子量分别为110.44kD和110.36kD，酸性氨基酸分别占总氨基酸的14.50%和14.61%，碱性氨基酸分别占13.37%和13.06%，理论等电点分别为5.95和6.16，稳定系数分别为45.35和44.35，两PEPC单条肽链均属于不稳定蛋白。用DNAman分析W14和Arg7PEPC蛋白的二级结构表明，两PEPC的蛋白质螺旋(α-helix,379AA）均占39.27%，折叠片(pleatedsheet,99AA)均占10.26%，无规卷曲(Coil,487AA)均占50.47%，说明木薯PEPC主要以无规卷曲为主，间或螺旋和折叠。亲水性、疏水性以及跨膜蛋白分析、信号肽分析表明，W14和Arg7的PEPC没有跨膜区及信号肽。所有植物的PEPC氨基酸序列由2个区域构成，1个保守区域(C末端区)和1个可变区域(N末端区)，C末端有100个氨基酸总是保守不变的。本文选择的其它物种PEPC氨基酸序列均具有多个高度保守的区域，W14和Arg7的PEPC氨基酸序列在第159~312个氨基酸间仅有12个氨基酸与其它物种略有差异，其它都是保守序列，另一处较大的保守区在745~789个氨基酸间。除拟南芥外，这45个氨基酸在这些物种间是共有的序列。C末端是高度保守的，来源不同的PEPC氨基酸序列长度的差异几乎都是由在N末端或内部区域中添加或缺失额外的氨基酸序列引起的。高度保守的残基和基序可能与酶的活性位点和调控有关。通过CDD搜索，W14和Arg7的PEPC均在34~964氨基酸位点间存在一个典型的大Ppc结构域(图1)。根据PROSITE数据库分析表明，W14和Arg7的PEPC氨基酸序列含均有2个大的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性位点，且都是位于168~179氨基酸位点(PS00781,VlTAHPTQsvRR)和591~603氨基酸位点(PS00393,VMIGYSDSgKDAG)(图1)。搜索蛋白质的Motif，W14和Arg7的PEPC功能位点分别为44和47个(图1)，均可分为7种模式：依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点(cAMP-andcGMP-dependentproteinkinasephosphorylationsite,PS00004)2个；酪蛋白激酶II磷酸化位点(CaseinkinaseIIphosphorylationsite,PS00006)分别为15和16个；蛋白激酶C磷酸化位点(ProteinkinaseCphosphorylationsite,PS00005)分别为14和15个；N端糖基化位点(N-glycosylationsite,PS00001)1个；酰胺化位点(Amidationsite,PS00009)分别为1和2个；N端十四烷酰化位点(N-myristoylationsite,PS00008)8个；酪氨酸激酶磷酸化位点(Tyrosinekinasephosphorylationsite,PS00007)3个。

2.4PEPC氨基酸序列同源性及系统进化分析多重比对分析结果表明：Arg7和W14的PEPC氨基酸序列与麻疯树的同源性最高，均达95.00%；其次是蓖麻，分别为94.81%与94.72%；与拟南芥、落花生(Arachishypogaea)、柑橘(Citrussinensis)、黄花菊(Flaveriatrinervia)、橹豆(Glycinemax)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、白羽扇豆(Lupinusalbus)、玉米的分别为88.56%、88.53，89.20%、88.90%，91.61%、91.62%，86.11%、86.12%，91.81%、91.71%，93.11%、92.80%，86.96%、86.97%和88.50%、88.10%。对PEPC氨基酸序列进行系统进化分析结果表明(图2)，两种木薯的亲缘关系最近，最先聚类，然后与大戟科的麻疯树、蓖麻和陆地棉聚在一起。木薯的PEPC与柑橘以及C4植物玉米等热带起源作物的PEPC呈现出进化的相似性；而落花生和白羽扇豆的PEPC与木薯的PEPC进化关系较远。此外，从图3还可看出，木薯PEPC与蓖麻和麻风树的PEPC1最先聚合，与其它物种如拟南芥的多个pepc基因家族成员编码的PEPC1的遗传距离更近，可推测本研究克隆的两个木薯pepc基因属于pepc基因家族编码PEPC1的类型。一般来说，C4型PEPC蛋白的C末端对应于第774位或附近的氨基酸残基都为丝氨酸(S)，而所有C3型PEPC蛋白相应位置均为丙氨酸(A)。本研究克隆得到的两种木薯PEPC蛋白在C末端第774位氨基酸均是丙氨酸，表明本研究得到的两个木薯PEPC蛋白都属于C3型。

2.5木薯pepc基因的表达用RT-PCR的方法分析了pepc基因在木薯野生种和栽培种不同组织中的表达谱。结果表明，pepc在W14和Arg7的须根、块根、叶中均有表达，且在功能叶中的表达量最高，而在茎中的表达量较少(图3)。2.6木薯pepc基因在叶片中的单日动态表达用实时定量表达分析法，研究了温室生长条件下W14和Arg7的pepc基因在功能叶的单日表达情况，结果表明，W14与Arg7的pepc基因表达存在较大差异(图4)。从上午8∶00到14∶00，栽培种Arg7中pepc基因的表达量明显高于W14，尤其是8∶00。从下午16∶00到18∶00，Arg7的pepc基因表达量则低于W14，但是最高表达水平出现在Arg7中。

3讨论

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是植物，尤其是C4植物光合作用过程的关键酶，在C3植物中，该酶为三羧酸循环(Tricarboxylicacidcycle)补充四碳二羧酸水平起着回补反应的功能[14]。菊科(Asteraceae)黄菊属(Flaveria)植物是研究C4PEPC进化的独特例子,黄菊属的一些物种分别含有C3、C4及C3-C4中间型的PEPC，研究表明C4型pepc基因是由C3型pepc基因进化而来的[15]。目前，已有大量的研究证明应用pepc基因的超表达可以显著提高C3植物如水稻[16–17]、小麦(Triticumaestivum)[18]等经济作物的光合速率,最终提高作物的产量。麻疯树pepc基因cDNA全长序列[19]以及PEPC在C末端的高度保守性为本研究pepc基因的克隆提供了可靠的序列信息。本研究首次从木薯野生种W14和栽培种Arg7中克隆得到了木薯pepc基因cDNA全长序列。它们的氨基酸序列在进化树中最先与同为大戟科的蓖麻和麻疯树聚合,遗传距离最近,然后才与锦葵科(Malvaceae)的落地棉、豆科(Leguminosae)的落花生和白羽扇豆聚合,与十字花科(Cruciferae)的拟南芥距离较远,表明PEPC在进化过程中既具有较强的保守性,又存在不同的种属间的差异。木薯叶片高光效的机制一直是木薯高淀粉率研究的关键点。有研究证明木薯栽培种叶片具有类似于C4类型植物叶片的维管束鞘细胞结构[6]，并且叶片中的PEPC活性明显高于野生型木薯[6–7]。本研究结果表明，木薯野生种和栽培种pepc基因高度同源(达98%)，且编码的氨基酸序列仅存在较小差异(同源性达99%)。W14和Arg7功能叶pepc的单日动态表达存在明显差异(图4)，该基因在W14和Arg7的须根、块根、功能叶中均有较高表达，在茎中表达量较低(图3)，这可能是由基因的表达调控差异造成的。因此，克隆木薯野生种W14和栽培种Arg7pepc基因的表达调控区域——启动子将是下一步的研究重点，以解释木薯野生种和栽培种pepc基因表达差异的原因。