实时荧光定量聚合酶链反应与酶链免疫法检测儿童疱疹病毒感染的临床评价

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［摘要］　目的：比较实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)与酶链免疫法(ELISA)两种不同方法检测传染性单核细胞增多症儿童及正常儿童疱疹病毒(EBV)感染与临床符合情况。方法：应用实时荧光定量PCR与ELISA法同步平行检测我院2006年1月至6月期间125例被临床诊断为传染性单核细胞增多症的儿童发烧第7天及50例门诊体检健康的儿童血标本中EBV的检出率。结果：125名传染性单核细胞增多症儿童中，其中1周岁以下20名，4周岁～10周岁105名，PCR法检出124例，阳性符合率99.2％。ELISA法检出107例阳性符合率85.6％，但1周岁以下的20名儿童，PCR法检出19例，阳性符合率95％，而ELISA法检出10例，阳性符合率仅为50％；50例健康儿童，PCR法检出49例，阴性符合率98％，ELISA法检出42例，阴性符合率84％。结论：PCR法与ELISA法比较，前者的阳性及阴性检出率均明显优于后者，特别是对于1周岁以下的儿童。与ELISA法相比PCR法是一个快速、敏感、特异的检测方法，可帮助临床明确诊断及早治疗。

［关键词］　疱疹病毒；酶链免疫；实时荧光定量聚合酶链反应；传染性单核细胞增多症

EBV又称人疱疹病毒4型，属于r疱疹病毒亚科淋巴滤泡病毒属成员，1968年Henle等证明EBV是传染性单核细胞增多症的病原体。全世界约有80％～90％成年人感染过EBV，初次感染者一般发生在10岁以前［1］。传染性单核细胞增多症的并发症包括脾肿大、肝炎、心包炎或累及中枢神经系统，故对于儿童明确诊断及早治疗尤为重要。本实验目的是对PCR法与ELISA法检测儿童EBV感染进行临床应用的比较及评价。

1　材料与方法

1.1　仪器　上海枫岭生物有限公司提供的FTC—2000型实时荧光定量PCR仪;上海迅达医疗仪器有限公司提供的XD—711酶标分析仪;北京拓普分析仪器有限责任公司提供的DEM—Ⅲ型自动酶标洗板机。

1.2　试剂　中山大学达安基因股份有限公司提供的EBV核酸扩增荧光定量检测试剂盒；北京北方生物技术研究所提供的EB病毒IgM?VCA，检测试剂盒(VCA即衣壳抗原)。

1.3　标本　阳性对照组125例均来自我院被临床诊断为传染性单核细胞增多症的住院儿童(其中1周岁以下20名)；阴性对照组50例均来自我院门诊体检的健康儿童，同时平行抽取1.5 ml～2.0 ml血液枸橼酸钠抗凝，用于PCR法检测；抽取1.0 ml血液注入干燥管用于ELISA法检测。

1.4　操作

1.4.1　PCR法　将上述抗凝的血液标本低速离心取血浆40 μl加等量DNA裂解液充分混匀提取DNA，得到的溶有DNA的水相准确吸取2　μl，直接用于PCR扩增。扩增条件为：93 ℃ 120 s 1个循环；93 ℃45 s 55 ℃60 s 10个循环；93 ℃ 30　s 55 ℃ 45　s 35个循环。在55 ℃ 45 s时采集荧光强度。试剂盒提供的阳性标准品(104～107)以及阴性对照、空白对照、临界值对照同时扩增，得出所测标本的核酸载量值，用拷贝/ml表示，为方便比较将≥103视为阳性，<103为阴性。

4.2　ELISA法　将上述未抗凝的血液标本，待自然凝固后，低速离心，取血清1∶10稀释，严格按照试剂盒所要求的操作步骤进行操作，同时作空白、阴性、阳性对照各2孔。用酶标仪读数，取波长450 nm，先用空白对照孔调零，然后测定各孔OD值。判断值(CO)=阴性对照平均OD值×2.1样品OD值大于、等于判断值为阳性；小于判断值为阴性。

2　结果

阳性对照组结果见表1。

表1　PCR法与ELISA法阳性对照组结果(略)

1周岁以下的20名儿童阳性检出率见表2。

表2　1周岁以下20名儿童两种方法阳性比较(略)

阴性对照组结果见表3。

表3　阳性对照组结果(略)

125名传染性单核细胞增多症儿童中(1周岁以下20人)PCR法检出124例阳性检出率99.2％，ELISA法检出107例，阳性检出率85.6％，但对于其中1周岁的20名儿童，PCR法检出19例，阳性检出率达95.0％，而ELISA法仅检出10例，阳性检出率仅为50.0％。对50名健康儿童PCR法检出49例，阴性检出率为98.0％，ELISA法检出42例，阴性检出率为84.0％。

3　讨论

由于EBV体外培养唯一的易感细胞为新鲜分离的人脐带血B淋巴细胞，而且标准的脐带血淋巴细胞转化方法需2周～4周的时间，用时太长使EBV的分离培养用于临床诊断没有意义。近几年来由于ELISA法的广泛应用，且IgM?VCA在初次感染时很早出现，4周后消失，因此临床上大多在初次感染时ELISA法检测IgM?VCA在临床上应用较为广泛，但有文献报道初次感染的诊断不能依赖于IgM?VCA的检测，在IgM?VCA的检测中假阳性和假阴性均可发生，前者由于类风湿因子的存在，而后者是由于血清标本采集的延迟及免疫抑制等原因所引起［1］，有文献报道在他们的实验室做IgM?VCA检测的传染性单核细胞增多症患者中，大约有85.0％～90.0％血清标本IgM?VCA阳性［2］，我院125例单核细胞增多症儿童患者中ELISA法检出率为85.6％与以上报道相符，但对于1周岁以下的儿童检出率仅有50.0％，而PCR法的阳性检出率明显高于前者；阴性对照组ELISA法阴性检出率为84.0％，而PCR法的阴性检出率可达98.0％。综上可见实时荧光定量PCR无论特异性或敏感性均明显优于ELISA特别是对于1周岁以下的特殊人群，由于其免疫系统尚未完全成熟，免疫力相对低下，在被EBV感染后机体很难在较短时间内产生大量的抗体，达到检测下限，使得用ELISA法检测的阳性率大大降低。PCR法检测的是EBV的DN段，不受其他因素的影响，补充了ELISA法的不足，更能快速、准确、特异地检测EBV的感染，帮助临床尽早诊断，及时治疗。

参考文献：

［1］　刘运德，等.微生物学检验.

［2］　徐建国.梁国栋，等.临床微生物学手册.