丹酚酸抗氧化活性及其对DNA损伤保护作用

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作者：柳艳，李磊，刘王莹，陈茂勇，吴倩

【关键词】 丹酚酸；抗氧化；DNA损伤；化学发光

摘要： 目的 探讨丹酚酸抗氧化活性及其对dna氧化损伤的保护作用机制。方法 运用自由基反应模型观察丹酚酸对二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)和羟自由基的淬灭效应，使用邻菲罗啉(Phen)-CuSO4-VC-H2O2-DNA化学发光体系测定丹酚酸对DNA损伤的抑制作用。高效液相色谱(HPLC）测定丹酚酸的组成。结果 丹酚酸水提物(AE)、乙酸乙酯萃取物(EE)、大孔吸附树脂纯化物（RE)和对照维生素(VC)、二丁基羟基甲苯(BHT)对DPPH自由基的半数清除浓度(IC50)分别为1412，153，146，158和715μg/ml。化学发光体系中，丹酚酸的加入能明显抑制并延迟DNA损伤。AE、EE、RE抑制发光50％浓度(IC50)值分别为12936，620，492μg/ml。丹酚酸清除DPPH自由基能力和对羟自由基攻击的DNA损伤保护作用受丹酚酸组成和丹酚酸B含量的影响。结论 丹酚酸属于预防型和断链型抗氧化剂，并可有效清除DPPH和羟自由基，对DNA损伤有明显保护作用。丹酚酸的抗氧化活性及对DNA损伤的保护作用与丹酚酸B含量有关。

关键词： 丹酚酸；抗氧化；DNA损伤；化学发光

Antioxidant activiy and protection effect of salvianolic acids on DNA damage

Abstract： Objective To study on the antioxidant activity of salvianolic acids and mechanisms of its protection against DNA antioxidative damage.Methods Free radical model was employed to investigate the scavenging activity to 1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) and hydroxyl free radicals.The mechanisms of the effects of salvianolic acids on protection against DNA damage was measured by chemiluminescence on the reaction system of phenanthroline (Phen)-CuSO4-VC-H2O2-DNA.Salvianolic acids composition in samples were determined according to HPLC analysis.Results The hemi-inhibitable concentration(IC50) of crude aqueous extract(AE)，ethylacetate extract(EE)，resin extract(RE)，ascorbate(VC) and butylated hydroxytoluene(BHT) to DPPH free radicals were 141.2，15.3，14.6，15.8 and 71.5μg/ml.Three extracts could obviously inhibit and delay DNA damage caused by hydroxyl free radicals.The IC50 valvue of chemiluminescence of AE，EE and RE were 1293.6，62.0，and 49.2μg/ml.The scavenging activity and protective effects against DNA damage were effected by salvianolic acids composition and salvianolic acid B level.Conclusion Salvianic acids can effectively scavenge DPPH and hydroxvl free radicals，protect against DNA damage which belongs to preventive and chain-breaking antioxidants，and the effects are related to salvianolic acid B level.

Key words： salvianolic acid；antioxidant；DNA damage；chemiluminescence

丹参是我国防治心脑血管病的传统药物，对冠心病、高血压、糖尿病肾病及癌症等疗效确切。近20多年来的药效研究表明，丹酚酸是丹参活血化瘀作用的主要功能成分〔1〕。自由基参与机体多种疾病的发生和发展过程，清除自由基、提高机体抗氧化能力，是许多药物防治慢性疾病的重要途径〔2，3〕。从化学结构上分析，丹酚酸类化合物是酚羟基的供体，具有抗氧化活性的结构基础。本文研究了丹酚酸对二苯代苦味酰肼自由基(DPPH）的清除效应，并探讨其对体外DNA氧化损伤的保护作用及可能机制，为进一步研究丹酚酸药理作用提供科学依据。

1 材料与方法

11 仪器及色谱条件 LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；DU600紫外-可见分光光度计(美国Backman公司)；Orion II高灵敏度板式化学发光检测仪(德国Berthold Detection Systems公司)。Alltima C18(150mm×46mm，5μm)色谱柱；流动相为水(05％冰醋酸)(A)-乙腈(B)；梯度条件：0～30min时5％～25％β,30～60min时25％～30％B；流速10ml/min；柱温为室温；检测波长280nm；进样量20μl。

12 试剂 丹酚酸B对照品(中国药品生物制品检定所，批号111562-200403);二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)、DNA、维生素C(VC)(美国Sigma公司)；二丁基羟基甲苯(BHT)(上海凌峰化学试剂有限公司)；实验用水为超纯水(182MΩ)，其余试剂为分析纯。不同含量和组成的丹酚酸水提取物(AE)、乙酸乙酯萃取物(EE)、大孔吸附树脂纯化物(RE)(本实验室自制)。

13 方法

131 DPPH自由基清除法 参照文献〔4〕。反应体积为3ml，取05m1不同浓度的样品加入6×10-5mol/L的DPPH乙醇溶液中，混匀后室温下测定DPPH反应液在517nm处的吸光度。BHT、VC作对照比较。样品对DPPH的清除率(％)=［A0-A样)/A0］×100%。A0为DPPH对照在时间t=0时的吸光度值，A样为加有样品的DPPH t=30min时的吸光度值。

132 清除羟自由基及对DNA损伤的保护作用 参照文献〔5〕。采用邻菲罗啉(Phen)-CuSO4-VC-DNA体系检测清除羟自由基及对DNA损伤的保护作用。用01mol/L醋酸盐缓冲液(pH55)配制Phen-CuSO4-VC-DNA溶液，使Phen、Cu2+、VC和DNA的最终浓度分别为35×10-3mol/L、15×10-4mol/L,28×10-3mol/L、150μg/ml。加入一定量的样品(对照用缓冲液补齐)。取该溶液1ml，放入发光仪样品池中，加入200μl 30％的H2O2溶液，混匀，启动发光反应，连续测定发光强度(CL)。发光强度抑制率(％)=［(CL对照-CL样品)/CL对照］×100。

2 结果

21 丹酚酸清除DPPH自由基的能力 在本实验条件下，DPPH浓度在5～60μmol/L范围内与517nm下的吸光度有良好线性关系，Y=00104X+00051(R2=09999)。不同的丹酚酸在各浓度下对DPPH自由基均有清除作用，其清除能力与浓度在一定范围内呈量效关系。AE、EE、RE、VC、BHT对DPPH自由基的半数清除浓度(IC50)分别为1412，153，146，158，715μg/ml。其中，丹酚酸EE、RE和丹酚酸B在5～25μg/ml范围内随着浓度的增大，清除DPPH能力呈线性增加。当样品浓度进一步增大到50μg/ml后，其清除能力增加趋于平稳，清除反应的量效关系与VC相似。在5～200μg/ml浓度范围内,AE清除DPPH的浓度效应呈线性关系，浓度为200μg/ml时，AE清除DPPH的能力达到710％，接近于同浓度下BHT的水平。实验观察了不同样品在浓度为25μg/ml时对DPPH自由清除能力的动力学变化(30min)。AE、EE、RE在30min内吸收值均不断下降，超过30min后仍有下降趋势。而对照AsA在反应启动后，能快速清除DPPH自由基(6×10-5mol/L)，并达到平衡。

22 对羟自由基损伤DNA的保护作用 Phen-CuSO4-VC-H2O2-DNA化学发光体系中，Phen在金属离子的催化下与H2O2作用，生成羟自由基，产生最大发射在445～450nm范围内的化学发光。羟自由基引起DNA损伤，能产生一延迟于Phen本身氧化发光信号的慢化学发光。最大发光波长范围在380～420nm。丹酚酸混合物AE、EE和RE均能有效防止羟自由基引起的DNA损伤。当AE终浓度分别为200，500，1000，2000μg/ml时，DNA损伤产物发光峰延迟时间分别为180，240，400，1220s；发光抑制率分别为1374％，2664％，4650％，6893％。EE终浓度为25，50，160，200，400μg/ml时，DNA损伤产物发光峰延迟时间分别为320，420，520，940，1980s；发光抑制率分别为2713％，5617％，7152％，7696％，9067％。RE终浓度为25，50，100，150，200μg/ml时，DNA损伤产物发光峰延迟时间分别为340，400，800，960，1040s；发光抑制率分别为3824％，4863％，6326％，7649％。丹酚酸的加入能使DNA损伤产物发光峰较空白对照组有明显下降，且有明显后移现象，浓度越大，作用越强。AE、EE、RE的抑制发光50％的浓度(IC50)分别为12936，620,492μg/ml。浓度为200μg/ml时，丹酚酸AE、EE、RE的延迟时间大小顺序为RE>EE>AE。可见，丹酚酸对DNA氧化损伤的保护能力大小依次为RE>EE>AE。

23 丹酚酸组成对抗氧化能力的影响

231 丹酚酸组份测定 外标法测丹酚酸B标准品在不同浓度下所得的峰面积，以浓度和对应峰面积建立线性回归方程，Y=15197X+92802(r2=09998)。测得丹酚酸样品AE、EE、RE中丹酚酸B的纯度分别为56％，744％，905％。AE、EE、RE中除丹酚酸B(保留时间为28465±010min)外，还存在5个共有峰，保留时间(min)分别为20748±005；22498±006,24032±007，25265±008，32698±020。分析各峰面积可知(AE、EE、RE浓度均为2mg/ml)，AE各峰面积均明显低于EE、RE，显示AE中总丹酚酸含量低于EE和RE。RE中峰2,3,6的面积分别是EE的112,655,387倍，而峰4,5的面积则低于EE，分别为EE峰面积的69％～40％。

232 丹酚酸组成与抗氧化能力的关系 丹酚酸对DPPH清除能力测定结果显示，EE、RE在各浓度下的清除率均明显高于AE，同时EE、RE与丹酚酸B标准品(纯度是993％)相比较，相同浓度(25μg/ml)下，EE、RE对DPPH的清除率分别为7897％和8194％,丹酚酸B的清除率为8259％。可见，丹酚酸B的纯度越高，其清除能力越强。在Phen-CuSO4-VC-H2O2-DNA化学发光体系中，与DPPH自由基清除能力相似，对DNA氧化损伤的保护能力大小依次为EE>RE>AE。可见，AE的抗氧化能力明显低于EE和RE，这与AE中的总酚含量低于EE和RE相一致。

233 丹酚酸B含量与抗氧化能力的相关性 相关性分析显示显示，在DPPH反应体系中，丹酚酸B含量低于13μg时，其含量与DPPH自由基清除能力之间有明显相关性(R2=08984)，含量进一步增大后，清除能力增加缓慢。原因可能是此反应浓度下的丹酚酸B能基本清除反应中的DPPH(6×10-5mmol/L)。在化学发光反应体系中，丹酚酸B的含量与发光抑制率间的关系也有明显的相关性(R2=08121)。由此推测，丹酚酸B可能是样品中主要抗氧化物质。

3 讨论

本实验表明，丹酚酸能有效清除DPPH自由基，对羟自由基致DNA损伤具有明显的保护作用，并存在一定的剂量效应关系，是一种有效的天然自由基清除剂。酚酸类化合物具有清除自由基的结构〔6，7〕，不同组成的丹酚酸，由于各单体间结构的差异引起其清除自由基能力的不同。其中丹酚酸B是由三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合合成，结构上含有多个游离酚羟基。因此，具有很强的提供氢质子的能力。从而阻断自由基链式反应，并能通过清除体系中产生的羟自由基消除对DNA的破坏作用。张健等〔8〕把自由基清除剂对DNA损伤的保护机制分为3种：①延迟DNA损伤，代表断链性作用；②抑制DNA损伤，代表预防性作用；③延迟兼抑制DNA损伤，代表断链兼预防性作用。不同组分的丹酚酸均可有效地清除羟自由基，降低DNA损伤程度且延迟DNA损伤发生的时间，表现出了丹酚酸具有断链兼预防性作用。本次研究重点观察了丹酚酸在体外2种自由基反应模型中的作用，表明其清除DPPH自由基能力及对DNA损伤的保护作用和丹酚酸B含量有一定相关性。丹酚酸组分表现出的抗氧化能力可能并不仅仅由于丹酚酸B的直接作用，而存在其他丹酚酸类单体提供的作用和相互影响，具体影响程度和原因有待于对未知丹酚酸峰作深入分析而确认。

参考文献

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