亚基交换在小分子热休克蛋白AgsA发挥类分子伴侣活性中扮演着重要的角色

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇亚基交换在小分子热休克蛋白AgsA发挥类分子伴侣活性中扮演着重要的角色范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

【摘 要】为了研究鼠伤寒沙门氏菌小分子热休克蛋白AgsA的亚基交换在其发挥类分子伴侣活性中的作用，本文通过将野生型AgsA和在C末端添加His-tag标签的AgsA在不同条件下与Ni-NTA Agarose混合，最后检测pull down下来的蛋白来分析目标蛋白的亚基交换情况。凝胶排阻层析和类分子伴侣活性测定结果显示，在C末端添加His-tag标签并不影响AgsA的寡聚状态和类分子伴侣活性。Pull down的研究结果表明，AgsA的亚基交换速率随着温度的升高而升高，而且，部分变性底物的存在也加速了AgsA的亚基交换速率。由于AgsA的类分子伴侣活性是随着温度的升高而升高的，由此可以推测，亚基交换在AgsA发挥类分子伴侣活性中扮演着重要的角色。

【关键词】小分子热休克蛋白 agsa 类分子伴侣活性 亚基交换

【Abstract】In order to study the role of subunit exchange in the chaperone-like activity of small heat shock protein AgsA from Salmonella enterica serovar Typhimurium， wild type AgsA and the AgsA with a His-tag added on the C terminus were mixed with Ni-NTA Agarose under different conditions， then the proteins pulled down were detected to analyse the subunit exchange of AgsA. The results of the gel exclusion chromatography analysis and chaperone-like activity assay showed that the added His-tag neither affected the oligomeric state of AgsA， nor the chaperone-like activity of AgsA. The results of the pull down assay showed that subunit exchange of AgsA occurred faster upon temperature increasing， and the presence of partial denatured substrate also accelerate the subunit exchange rate of AgsA. Since the chaperone-like activity of AgsA enhanced as temperature increased， it could be speculated that subunit exchange may play an important role in the chaperone-like activity of AgsA.

【Key words】small heat shock protein， AgsA， chaperone-like activity， subunit exchange

小分子热休克蛋白是一类普遍存在的应激蛋白，分子量在12C43 kDa之间，具有保守的、大约100多个氨基酸残基组成的a-crystallin结构域[1-2]。通常，小分子热休克蛋白在体外以多个亚基组成的球状寡聚体形式存在，这种寡聚体是一种动态的结构，在寡聚体之间发生着快速的亚基交换[3-4]，尽管关于该过程的机制和动力学都还知之甚少，越来越多的证据都表明亚基交换是小分子热休克蛋白发挥类分子伴侣活性必不可少的[5-9]。为了确定这种关系是否也存在于鼠伤寒沙门氏菌小分子热休克蛋白AgsA中，本文采用His-tag pull down法对该蛋白在不同条件下的亚基交换情况进行了研究。结果发现，AgsA的亚基交换速率随着温度的升高而升高，而且部分变性底物的存在也加速了AgsA的亚基交换，表明亚基交换在AgsA的类分子伴侣活性的发挥中也扮演着重要的角色。

1 材料和方法

1.1 材料

E. coli DH5α用于分子克隆操作，E. col BL21（DE3）用于目标蛋白的表达和纯化，pET21a-agsA质粒受赠于北京大学生命科学学院蛋白质科学实验室。Ni-NTA Agarose购自北京百汇中源有限公司。Insulin、DTT（dithiothreitol）购自Sigma公司。其他所有化学试剂均为分析纯量级。

1.2 方法

（1）重组质粒的构建 为了表达在C末端带有His-tag标签的AgsA，以质粒pET21a-agsA作为模板进行PCR扩增，所得DN段用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后，插入到质粒pET21a中，获得的重组质粒pET21a-agsA-his6转化到E. coli BL21（DE3）感受态细胞进行目的蛋白的表达。

（2）AgsA的表达与纯化 将含有重组载体的E. coli BL21（DE3）菌株小量培养过夜，转接至新鲜LB培养基中于37oC，200 rpm条件下大量培养，当细菌长至OD600约为0.6时，加入1 mM的IPTG，继续培养约6 h。5000 rpm离心10 min收获菌体，去离子水洗涤后冻存于-20oC过夜。不带His-tag标签的AgsA的纯化方法参考Shi等人的操作步骤[10]。对于带有His-tag标签的AgsA，冻存菌体在冰上缓慢融化之后，用含有1 mM蛋白酶抑制剂PMSF的缓冲液A（50 mM Na3PO4，50 mM NaCl，20 mM咪唑，pH 7.5）重悬后进行超声破碎。细胞裂解液于15000 g离心40 min，收集上清上样于Ni-NTA柱，随后用缓冲液B（50 mM Na3PO4，1 M NaCl，20 mM咪唑，pH 7.5）洗脱杂蛋白，最后用缓冲液C（50 mM Na3PO4，50 mM NaCl，250 mM咪唑，pH 7.5）进行目的蛋白的洗脱。采用BCA法对纯化所得蛋白进行浓度测定。

参考文献：

[1] Kappe， G.， Leunissen， J.A.， and de Jong， W.W. （2002）. Evolution and diversity of prokaryotic small heat shock proteins. Prog Mol Subcell Biol 28， 1-17.

[2] Haslbeck， M.， Franzmann， T.， Weinfurtner， D.， and Buchner， J. （2005）. Some like it hot： the structure and function of small heat-shock proteins. Nat Struct Mol Biol 12， 842-846.

[3] Bova， M.P.， McHaourab， H.S.， Han， Y.， and Fung， B.K. （2000）. Subunit exchange of small heat shock proteins. Analysis of oligomer formation of alphaA-crystallin and Hsp27 by fluorescence resonance energy transfer and site-directed truncations. J Biol Chem 275， 1035-1042.

[4] Bova， M.P.， Ding， L.L.， Horwitz， J.， and Fung， B.K. （1997）. Subunit exchange of alphaA-crystallin. J Biol Chem 272， 29511-29517.

[5] Bova， M.P.， Huang， Q.， Ding， L.， and Horwitz， J. （2002）. Subunit exchange， conformational stability， and chaperone-like function of the small heat shock protein 16.5 from Methanococcus jannaschii. J Biol Chem 277， 38468-38475.

[6] Gu， L.， Abulimiti， A.， Li， W.， and Chang， Z. （2002）. Monodisperse Hsp16.3 nonamer exhibits dynamic dissociation and reassociation， with the nonamer dissociation prerequisite for chaperone-like activity. J Mol Biol 319， 517-526.

[7] Fu， X.， Liu， C.， Liu， Y.， Feng， X.， Gu， L.， Chen， X.， and Chang， Z. （2003）. Small heat shock protein Hsp16.3 modulates its chaperone activity by adjusting the rate of oligomeric dissociation. Biochem Biophys Res Commun 310， 412-420.

[8] Jiao， W.， Qian， M.， Li， P.， Zhao， L.， and Chang， Z. （2005）. The essential role of the flexible termini in the temperature-responsiveness of the oligomeric state and chaperone-like activity for the polydisperse small heat shock protein IbpB from Escherichia coli. J Mol Biol 347， 871-884.

[9] Usui， K.， Hatipoglu， O.F.， Ishii， N.， and Yohda， M. （2004）. Role of the N-terminal region of the crenarchaeal sHsp， StHsp14.0， in thermal-induced disassembly of the complex and molecular chaperone activity. Biochem Biophys Res Commun 315， 113-118.

[10] Shi， X.， Wang， Z.， Yan， L.， Ezemaduka， A.N.， Fan， G.， Wang， R.， Fu， X.， Yin， C.， and Chang， Z. （2011）. Small heat shock protein AgsA forms dynamic fibrils. FEBS Lett 585， 3396-3402.

[11] Tomoyasu， T.， Tabata， A.， and Nagamune， H. （2010）. Investigation of the chaperone function of the small heat shock protein-AgsA. BMC Biochem 11， 27.

[12] Fu， X.， and Chang， Z. （2004）. Temperature-dependent subunit exchange and chaperone-like activities of Hsp16.3， a small heat shock protein from Mycobacterium tuberculosis. Biochem Biophys Res Commun 316， 291-299.

基金项目：国家自然科学基金（81300930）；江苏省自然科学基金（BK20130232）

*通讯作者：石小东