持续性根尖周炎根管外菌群分析
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[摘 要] 目的：分析持续性根尖周炎（Persistent periapical periodontitis，PRP）根管外菌群特点，明确根管外菌群在PRP发生、发展中扮演的角色。方法：我院拟行根尖手术的PRP患者中选取13例13颗患牙及10例10颗正畸拔除牙，使用Brown&Brenn染色进行观察及细菌培养。结果：正畸拔除牙染色结果均未见明显异常。PRP患牙Brown&Brenn染色可见相互交织、聚集的革兰阴性菌及革兰阳性菌。13颗患牙共检出根管外菌群86个，检出菌种以兼性厌氧菌、专性厌氧菌、需氧菌为主，其中丙酸菌属检出率最高，构成比为16.3%，其次为放线菌属，构成比为12.8%。结论：PRP存在根管外感染，其感染菌群以丙酸均属、放线菌属为主，在PRP发生发展过程中占据了重要地位。
[关键词] 持续性根尖周炎；根管外菌群；细菌培养
中图分类号：R781.3 文献标识码：B 文章编号：2095-5200（2016）03-043-03
DOI：10.11876/mimt201603016
持续性根尖周炎（Persistent periapical periodontitis，PRP）是指原发性根尖周炎经完善的根管治疗后，根尖周病变未愈或出现新的根尖周病变[1]。根管外感染是导致PRP绵延不愈的主要原因，且根管预备、根管消毒及根管充填等前期治疗过程往往导致根管外致病微生物群落发生变化以及局部微生态环境复杂度加剧[2]。因此，明确PRP根管外菌群构成特点，是了解其作用机制、解释治疗失败原因、指导根管感染预防和治疗的关键[3]，目前国内关于这一方向文献较为缺乏。我们以13颗拟行根尖手术的PRP患牙及10颗正畸拔除牙为样本进行了前瞻性对照分析，具体如下。
1 一般资料
本研究患者均知情同意并签署知情同意书。PRP患牙选取标准：1）参照文献标准确诊PRP，拟行外科手术或拔除治疗[4]；2）根管治疗次数≥2次，距离上次慢性根尖周炎治疗时间≥2年；3）X线片可见根充止点距离根尖距离在0～2 mm内，根管充填致密但根尖病损未见治愈，且根尖伴有直径
2 研究方法
2.1 样本采集
正畸拔除牙样本采集：将患牙拔除后立即置入含有0.9%灭菌生理盐水的采样瓶中，并迅速转移至实验室超净工作台，以0.9%灭菌生理盐水充分冲洗表面血污。术中操作严格遵循无菌原则。
PRP患牙样本采集：术前嘱患者使用0.12%氯己定漱口3 min，而后以2%利多卡因（含1：50000肾上腺素）局麻，使用1%碘酊行术区消毒。按照术前X线片示病变范围，术中作弧形切口，将全厚瓣切开，使用灭菌低速手机及球钻将根尖区颊侧骨质切除，使根尖病损区域暴露，而后使用无菌挖匙将根尖周围肉芽组织完全挖除，暴露根尖。使用灭菌高速手机及金刚砂车针，沿牙长轴垂直方向截取根尖样本，截取长度约为3 mm[5]。手术全程使用无菌生理盐水降温，取样过程中严格避免唾液污染，并尽可能减少根尖组织与空气的接触[6]。分离样本后的放置、转移处理同正畸拔除牙样本采集。
2.2 样本观察
细菌Brown&Brenn染色：将获取的全部样本使用2%戊二醛于4℃环境下固定48 h，使用无菌轮型金刚砂车针于超净工作台中截取样本。截取完毕后，使用去离子水洗涤3次，注意洗涤操作需轻柔、缓慢，而后加适量去离子水，于-80℃冰箱中冷冻过夜，取出后置入冷冻干燥机中，48 h后以灭菌10% EDTA脱钙液持续脱钙35～40 d，每隔2～3 d更换一次脱钙液。脱钙完毕后，行脱水、石蜡包埋处理，自根尖向牙冠方向制备横断面连续组织切片，厚度为5 μm。使用细菌Brown&Brenn染色处理切片，置于光学显微镜下拍照、观察[7]。
细菌培养：将样本置于转运液中，加入灭菌玻璃珠（直径3 mm），漩涡振荡5 min，分离根管外微生物，以12000 r/min离心5 min，取沉淀物，使用细菌DNA提取试剂盒，利用16S rDNA克隆测序法对菌群特点进行分析[8]。
3 结果
3.1 细菌染色结果
染色结果显示PRP患牙根尖区外表面可见明显染色阳性的根管外生物膜包绕，并存在红染革兰阴性菌、紫染革兰阳性菌相互交织或积聚成团，周围包绕大量基质样物质，形态包括球菌、杆菌、放线菌及螺旋菌等，根管外生物膜厚度17～31 μm；部分PRP患牙根面可见牙骨质吸收区，且吸收陷窝中积聚大量细菌，细菌侵入牙本质但未累及牙髓腔。正畸拔除牙样本染色仅见牙本质及牙骨质，显黄染，未见红染或紫染区域。
3.2 细菌培养结果
13颗患牙共检出根管外菌群86个，检出菌种以兼性厌氧菌、专性厌氧菌、需氧菌为主，其中丙酸菌属（丙酸杆菌属、丙酸丙酸盐杆菌）检出率最高，构成比为16.3%，其次为放线菌属，构成比为12.8%，见表1。
4 讨论
临床上约有10%～20%的根尖周炎患者在接受规范的根管治疗方案后，影像学仍可见持续性或进行性扩大的根尖周暗影，并伴有咬合痛等各类主观不适症状，经反复治疗仍无法得到有效缓解[9]。根管系统内和根尖孔外存在的微生物定植及感染是导致根管治疗效果受限的主要原因[10]，定植于根管内的细菌可自根尖孔侵入根管外，并于牙骨质上形成生物膜结构，影响常规机械和药物性牙髓治疗效果。
有研究应用扫描电镜[11]对PRP患牙进行观察，结果显示，PRP患牙扫描电镜可见明显病变状态及大量细菌定植。扫描电镜可获取准确、清晰的形态学信息，能够有效显示生物膜表面结构，但对生物膜内细菌形态和分布的观察作用十分有限，这主要与细菌在成熟生物膜结构中常被大量基质样成分包绕有关[12]。因此，需采用其他方案进一步判断生物膜是否存在、明确生物膜结构状态[13]。本研究以细菌Brown&Brenn染色、DNA测序方法进行对照研究。
细菌Brown&Brenn染色结果表明，正畸拔除牙样本未见胶原纤维吸收、牙骨质破坏等病损状态，且未见红染或紫染区域，与Wang等[14]研究结果相同，表明正畸拔除牙根管外无生物膜形成，亦不存在细菌感染。PRP患牙根管外可见大量革兰阳性菌、革兰阴性菌定植，并在生物膜的包绕下附着于根尖区外表面，且伴随着根尖骨质吸收、胶原纤维破坏甚至牙骨质的暴露与吸收。Murad等[15]指出，生物膜的特殊结构可将细菌包裹于胞外基质中，将细菌与机体免疫防御因子及液体冲刷隔离开来，对细菌的繁殖、生长起到保护作用，且根管外生物膜常处于隐蔽位置，常规根管治疗往往无法涉及这些部位，导致治疗效果受限。此外，Tennert等[16]发现，处于胞外基质的细菌可结合抗菌因子，在阻止抗菌因子向胞内扩散的同时增强生物膜的耐药性，进一步影响抗菌药物发挥作用。上述机制可能是导致PRP绵延难愈的主要原因，Segura-Egea等[17]亦发现，病程越长、生物膜中细菌数量越高、细菌毒性越强及分布范围越大的PRP患者，治疗越困难且预后更差。我们通过扩增细菌16S rDNA序列发现，PRP根管外菌群以放线菌属和丙酸菌属为主，与Van der Waal[18]等研究结论相仿。
本研究在解释PRP发生机制的同时，也为PRP治疗失败的原因提出了参考，即根管外菌群的大量定植及生物膜的良好保护作用，由于条件所限，我们未能进一步明确PRP根管外定植的具体菌群。总体而言，根管外菌群在PRP的发生发展过程中扮演了重要角色，在今后的临床治疗中，可以将清除根管外菌群作为努力方向。
参 考 文 献
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