凝胶法检查细菌内毒素应注意的问题
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[摘要] 为了确保凝胶法测定细菌内毒素的准确性，我们通过对凝胶法准确性干扰因素的分析(包括鲎试剂本身、操作条件、原料及其他)，指出了应用凝胶法测定细菌内毒素时应注意的问题。最后认为只要克服了检查中的干扰因素，凝胶法是最简单、经济、应用最广泛检查细菌内毒素的方法。此外此种方法对干扰不敏感，为《中国药典》的“仲裁”方法。
[关键词] 凝胶法；热原；注意事项
[中图分类号]R927 [文献标识码]C [文章编号]1673-7210（2007）10（b）-153-02
《中国药典》2005年版二部将细菌内毒素检查法分为凝胶法和光度测定法。因凝胶法具有最简单、经济，应用最广泛，对干扰不敏感的优点，因此为《中国药典》的“仲裁”检查方法，而广泛用于注射剂药品细菌内毒素的检查。
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。中国药典1995年版已收载细菌内毒素检查法(简称鲎试验)，但只用于几种输液的检查。根据现有的实验证明，凡不干扰细菌内毒素检查或虽有干扰，但可以克服的药品注射剂，将能够以凝胶法代替家兔热原检查法。多年以来的实践证明，进行细菌内毒素检查前必须具备的条件是：①实验所用器具“无细菌内毒素”；②鲎试剂灵敏度的确证；③无干扰因素。这3条也是检验细菌内毒素试验是否有效的重要标准。
用凝胶法做细菌内毒素的检查时应注意以下问题：
1 鲎试剂本身
1.1 鲎试剂灵敏度
为了保证检查细菌内毒素结果的准确性，用于试验的鲎试剂应首先核对灵敏度。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验对结果的改变时，需进行灵敏度复核试验。因为在我们的实际工作中，发现鲎试剂均符合药典规定标准前提下，由于生产厂家不同，批号不同，部分鲎试剂的实测灵敏度与标示值有差异而导致检测同一检品时，用相同标示值的鲎试剂，出现不同结果。因而先核对灵敏度可避免因鲎试剂本身造成的判断失误。建议到省、市、县药检所购入鲎试剂。
1.2 供试品溶液的制备
某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶质中浸提制成供试品溶液。首先确定供试品的内毒素限值(EU/ml)，公式为L=K/M，L为供试品内毒素限值，然后计算出供试品最大有效稀释倍数（MVD）MVD=cL/λ，其中c为供试品溶液的浓度，λ为在凝胶法中鲎试剂灵敏度 (EU/ml)。如选用更高灵敏度的鲎试剂，则应增加样品的稀释倍数。《中国药典》2005年版规定稀释用的细菌内毒素检查用水为小于0.015 EU/ml的灭菌注射用水。如果直接用供试品原液试验，就会使供试品的内毒素提高到0.5 EU/ml或0.5 EU/ml以下，这样，根据目前大输液的生产和贮藏条件，有些就会达不到，凝胶法检出的阳性率会提高，从而影响了结果的准确性。
2 操作条件
2.1 操作熟练程度
操作时严格按无菌操作法进行，安瓿开启前应消毒，再用砂石划痕(不管是色点或包环易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，一定要防止碎玻屑掉入安瓿内，要有一个比较整齐的颈口。在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加入时，取样均应准确量取。操作时，双手避免在安瓿或试管的上方来回移动，加样后应迅速封闭管口，并立即放入恒温水浴箱中，且整个操作过程中时间应紧凑，防止微生物的污染，否则易致假阳性的出现。
2.2 混合液的pH值
供试液与鲎试剂混合液的pH值对鲎试验的影响较大，2005年版《中国药典》要求供试品溶液的pH值在6.0～8.0的范围内，根据国内外资料的报道，试验的最适pH为6.25～7.25才能形成最佳凝胶。而药典规定各种葡萄糖注射液的pH为3.2～5.5，我院控制在4.5～4.9之间。我们曾对此pH范围的多批次葡萄糖注射液作了调pH和不调pH的比较试验，结果发现在该pH范围内两者无显著差异，不调pH者阴性抑制试验仍可得到坚实的凝胶，说明不影响反应灵敏度，且鲎试剂本身具有一定的缓冲能力。但pH值过大或过小均可抑制鲎试剂与细菌内毒素的反应，其原因可能是pH值过大或过小均可破坏极微量的内毒素。
2.3 保温温度
将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成1 EU/ml，进行鲎试验，然后分别放置于25、28、33、36、38、40、43、47、49℃水浴保温。实验中观察到凝胶形成的速度随着温度的升高而加快，但到达49℃保温90 min也未出现凝胶。
从实验可以看出，温度对鲎试剂的灵敏度影响很大，保温温度在25～40℃之间，随着温度的升高，鲎试剂的灵敏度亦增大，在40～46℃之间，温度对鲎试剂的灵敏度无明显影响，达到49℃或更高温度时，则会破坏鲎试剂。故应严格按照药典的要求，温度控制在(37±1)℃之间，才可获得准确的结果。
2.4 保温时间
将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成1 EU/ml，进行鲎试验，37℃水浴保温，分别在10、20、30、40、50、70 min时观察，发现凝胶形成的坚实状态随着时间的延长而坚固。
从上述实验可以看出，延长保温时间，可以提高鲎试剂的灵敏度，增加假阳性。故应遵守我国药典规定的保温(60±2) min时间。
在凝胶法操作中应防止试管受到振动，鲎试剂与细菌内毒素形成的凝胶受到振动后易变形而误判断为阴性。因此，不宜进行容易引起试管振动的实验操作，试验用的试管架的眼孔直径应与安瓿或试管直径相接近，避免安瓿或试管左右晃动。水浴箱要放置在不易受到振动的地方，保温过程中不可随时取出观察，观察结果时，要动作轻柔，缓缓倒转180°，避免引起振动，出现假阴性结果。
3 其他
3.1 配制的原料
在凝胶法检测中，0.9%氯化钠注射液多次出现假阳性反应，对此进行了实验工作，查找原因，发现阳性率高与厂家原料有关。笔者把不同厂家生产的氯化钠原料配制的0.9%氯化钠注射液，对不能通过鲎法检查的送药检所用兔法检查，结果为阴性，其中个别厂家的阳性率高于其他厂家，为此将不同厂家的氯化钠的原料分别在230℃烘焙1 h后进行比较，发现个别产品色泽明显变黄。按《中国药典》2005年版附录规定的易炭化物检查，分别将不同厂家的氯化钠原料进行易炭化物相对照检查，结果上述明显变黄厂家的氯化钠色泽较深。因此认为个别厂家的注射用氯化钠原料含有较多的有机杂质，希望厂家要控制好质量。另外，在葡萄糖原料中偶有存在着β-D-聚葡萄糖的现象，它可与鲎试剂发生凝集反应，但注入兔体内不能使其升温，故造成假阳性，所以最好是使用定点厂家合格的葡萄糖原料。
3.2 所用器皿均应彻底洗净和安全灭菌
实验用器皿均应充分洗涤并冲洗干净，特别是接触酸碱或用洗衣粉、洗液等洗涤后，更应冲洗干净，以免残留物破坏极微量的内毒素。灭菌应按《中国药典》中的有关方法处理，防止引入外源性内毒素。
3.3 阳性及阴性对照
《中国药典》2005年版规定鲎试验必须做阳性及阴性对照，每批供试品必须做2支供试品管、2支供试品阳性对照；同时，每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。当阴性对照液的平行管均为阴性，供试品阳性对照液平行管均为阳性，阳性对照液的平行管均为阳性，实验才有效。其目的就是证实实验条件下鲎试剂的活性，所以在实验过程中，阳性对照如为阴性，此次实验无效，应重新复做。另外细菌内毒素工作标准品溶解后要在旋涡混合器上混合15 min，以后每一步稀释前至少混合30 s，因为具有两级活性的内毒素分子在水中呈不均匀分布，不按要求会造成所稀释内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高，阳性对照不凝等不正确实验结果。
总之，检查大输液中的细菌内毒素是一项极为重要的指标，为了保证检查细菌内毒素结果的准确性，操作人员一定要严格按《中国药典》2005年版的有关要求去做，严把药品质量关，保证临床药品的质量。
[参考文献]
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].第二部.北京：化学工业出版社，2005. 86-87，附录XIE.
（收稿日期：2007-08-12）