HPLC测定黄连上清片中黄芩苷的含量

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【摘 要】建立反相高效液相色谱法测定黄连上清片中黄芩苷的含量。黄芩苷具有抗菌抗病毒、镇痛、抗肿瘤、清除氧自由基、抗炎、抗氧化、保护心脑血管及神经元、解热、保肝等作用。方法：采用奥泰公司 C18 色谱柱（220mm×4.6mm，5μm），水-甲醇-磷酸（50：50：0.01）为流动相，检测波长为315nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃。黄芩苷在5～30μg・mL-1范围内呈良好的线性关系。黄芩苷平均回收率分别为100.1%。结论：本法简便、准确，可用于黄连上清片中黄芩苷的含量测定。

【关键词】黄连上清片；含量；测定

黄连上清片由、连翘、蔓荆子（炒）、大黄、栀子（姜制）、黄芩、薄荷、黄柏（酒炒）、防风等组成。黄连上清片常用于内热火盛引起的头晕脑胀、口舌生疮、暴发火眼、大便干燥、小便色黄等。黄芩常用于湿温发热、胸闷、口渴不欲饮，以及湿热泻痢、黄疸等症[1-3]。《本经》记载：“主诸热黄疸，肠僻，泄利，逐水，下血闭，（治）恶疮，疽蚀，火疡。”黄芩含黄芩素（baicalein）、黄芩新素（neobaicalein）、汉黄芩素（wogonin）、7-甲氧基黄芩素（7-methoxbaic alein）、2，5，8-三羟基-7-甲氧基黄酮、黄芩苷等成分[4-6]。高效液相色谱法以液体为流动相，将具有不同极性的流动相泵入装有固定相的色谱柱，从而实现对试样的分析。文采用高效液相法，又根据本实验采用高效液相色谱法对黄连上清片中的黄芩苷的进行了含量测定。

1.仪器与试药

（1）仪器：SY-8100高效液相色谱仪（北京北分瑞利分析仪器（集团）公司）；SPECORD250 PLUS紫外可见分光光度计（德国耶拿分析仪器股份公司）；KQ250DE超声波清洗器超声波检测仪器（烟台鑫康商贸有限公司）；AE224 全触屏电子天平（海舜宇恒平科学仪器有限公司）；PH-620高精度实验室酸度计（上海禾工科学仪器有限公司）。

（2）色谱柱：奥泰公司 C18 色谱柱（220mm×4.6mm，5μm）。

（3）对照品：黄芩苷。

（4）试剂：甲醇、乙腈为色谱纯；水为纯化水，其它试剂均为分析纯。

（5）试药：黄连上清片。

2.测定方法确定

2.1色谱条件

依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下。流动相：水-甲醇-磷酸（50：50：0.01）为流动相，检测波长：315nm，流速：1.0ml・min-1。柱温：30℃。理论板数按黄芩苷峰计算应不得低于2000。

2.2对照品溶液的制备

精密称取黄芩苷对照品适量，置容量瓶中，加流动相制成每1mL含10μg的溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备

取装量差异项下的供试品精密称定，研细，精密称取（相当于黄芩苷100μg），置具塞锥形瓶中，精密加入流动相10mL，密塞，精密称定重量，超声处理10分钟，放冷，精密称定，用流动相补足重量，摇匀，滤过。取续滤液，即得。

2.4 专属性试验

依照处方取除黄芩，按样品制备工艺制成阴性对照样品，照2.3.3项下供试品溶液的制备方法制成阴性液，依上述方法测定，结果在黄芩苷出峰处阴性液无色谱峰，结果阴性试验没有干扰，表明本方法专属性良好。

2.5 精密度试验

精密称取黄芩苷对照品适量，加流动相使溶解，制成浓度为10μg・mL-1的供试品溶液。照上述色谱条件，精密吸取10μl，连续进样6次，记录峰面积。结果，RSD=0.63%，表明本方法精密度良好。

2.6对照品的线性考察

精密称取适量黄芩苷对照品，加入流动相溶液使溶解分别配制成每毫升含5、10、15、20、25、30微克的溶液。分别精密上述溶液吸取10μL，注人液相色谱仪，依照2.1项下的色谱条件测定，记录色谱峰。以峰面积（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明，黄芩苷在5～30μg・mL-1范围内呈良好的线性关系。

2.7重现性试验

称取同一批的黄连上清片样品6份，按测定方法项下的方法制备供试品溶液，测定含量，并计算样品的RSD值，结果RSD为0.81%，结果表明此方法的重现性良好。

2.8准确度试验

取对照品适量， 按处方比例及工艺规程制备模拟片各20片，含量分别相当于标示量的80%、100%、120%。取模拟片照“含量测定”项下方法试验， 计算回收率为 100.1%，RSD为0.69%。

2.9 最低检出限与定量

采用2.1项下色谱条件，对样品测定，当信噪比为10时，定量限为1.5ng；当信噪比为3时，最低检出限为0.4ng。

2.10样品稳定性试验

取同一批黄连上清片样品，按2.3项下的供试品制备方法制备供试品，将供试品置室温下放置，分别于第0、1、2、3、4、5、6小时，精密吸取供试品溶液10μl 注入液相色谱仪中，记录色谱图。测定黄连上清片中黄芩苷的RSD=0.53%。结果表明供试品6小时内稳定。

2.11样品含量测定

依照上述含量测定方法，测定黄连上清片三批样品中黄芩苷的含量，结果三批样品的含量分别为0.91毫克/片、0.93毫克/片、0.96毫克/片。

3.讨论

3.1流动相的选择

分别考察甲醇-水-三乙胺（70∶30：0.2），水-甲醇-磷酸（，30：70：0.01），水-甲醇-乙腈（50：20：30），水-甲醇-磷酸（50：50：0.01）不同比例的流动相，结果以水-甲醇-磷酸（50：50：0.01）为流动相为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用水-甲醇-磷酸（50：50：0.01）为流动相为流动相。

3.2检测波长的选择

制备黄芩苷对照品稀释液照紫外-可见分光光度法（中国药典2010版一部 附录ⅤA），于190～900nm波长范围内进行全波长光谱扫描，记录吸收光谱。在315nm处有最大吸收峰，故选用315nm为检测波长[1]。

本实验表明此方法分离效果好、方法简便、快捷、准确，、专属性好，可用于黄连上清片中黄芩苷的含量测定。

【参考文献】

[1]初明，初正云，丹.复方黄芩提取物对小鼠体内流感病毒mRNA复制和干扰素（IFN）表达的影响[J].中药材，2007（01）.

[2]刘菊福，卢长安，廖福龙，刘岱，崔淑莲，杨立新，冯学锋，杨京玉，胡世林.不同产地黄芩提取物主要药效作用的比较[J].中国中医药信息杂志，2001（03）.

[3]刘新文，李欣，杨燕宁，张家萍，张昌颖.黄芩黄酮对硒性白内障晶状体抗氧化酶表达的影响[J].中国生物化学与分子生物学报，2002（04）.

[4]刘媛媛，杨占秋，何静，石丽桥，肖红.MTT分析法、空斑减数法及CPE观察法评估药物体外抗病毒效果的比较与分析[J].武汉大学学报（医学版），2005（02）.

[5]宋琳莉，王微，孟庆刚.不同来源黄芩提取物抗流感病毒作用的实验研究[J].中国中医药信息杂志，2009（04）.

[6]吴修华，刘妮，杨丽，沈海容.黄芩素体内抗甲型流感病毒作用的研究[J].广州中医药大学学报，2009（02）.