优秀单板U型场地滑雪运动员外周血淋巴细胞cDNA文库构建及ESTs分析
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摘 要：建一个优秀单板U型场地滑雪运动员血液的cDNA文库，经测序从中获取大量的表达序列标签（Expressed Sequence Tags）ESTs，用于基因筛选和功能预测。方法：通过对多名优秀冰雪运动员血液样品的总RNA进行提取、混合总RNA，合成双链cDNA、蛋白酶K消化、Sfi1酶切并连接载体、λ噬菌体的包装，经扩增最终获得优秀冰雪运动员cDNA文库；随后从文库中随机挑选500个克隆提交至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，测序结果利用Chromas软件去低质量样品，使用GenBank中的BLAST功能对所获序列进行比对获取相关信息，将获得的ESTs信息提交PANTHR和GO（Gene Ontology）生物信息数据库进行基本归类分析，从中获取运动员cDNA文库中所涵盖的重要遗传信息。结果：得到滴度分别为1.32×106 pfu/mL和1.65×1010 pfu/mL的未扩增文库和扩增后文库，扩增后文库的重组率为90.6%；得到长度在300～1 100 bp序列360个，平均长度606 bp；通过BLAST比对得出201条具有注释的基因信息，利用PANTHER数据库基本分析发现这些基因分布在27个pathway上，其中TXN、MDH1、ARL1、ARPC3、ACTG1等基因分别分布在参与新陈代谢、氧化应激反应、心血管系统机能等相关联的信号通路上，推测其可能与运动能力存在关联。通过GO分析对所测序列进行归类得到在该数据库中具有功能注释的基因143个，参与31项不同功能，主要包括细胞组分、分子功能和生物过程。结论：构建了一个全长的运动员cDNA文库，其质量符合构建cDNA文库的标准。
关键词：单板U型场地滑雪；外周血淋巴细胞；全长cdna文库；表达序列标签
中图分类号：G 804.2 文章编号：1009-783X（2017）03-0254-05 文献标识码：A
Abstract： Objective： The aim of this study is to construct a cDNA library of blood from elite half-pipe snowboarders. And we can get a large number of ESTs （Expressed Sequence Tags） from it by sequencing the genes. We can also use it for gene screening and function prediction. Methods： The cDNA library of blood from elite half-pipe snowboarders was constructed by a series of experiments extracting and mixing Total RNA of several elite ice-snow athletes， synthesizing double-stranded DNA， proteinase K digestion， Sfi 1 enzyme digestion， connecting with vector， packaging phage λ and amplification. Then 500 clones from the library were randomly selected to be sequenced. Low-quality samples in the results of sequence were removed by Chromas software. The relevant information of ESTs was captured by matching gene sequences with BLAST of GenBank. Then the information of ESTs was presented to PANTHR and GO（Gene Ontology）bioinformatics database to make a basic classification and analysis and to get some important genetic information in the cDNA library of athletes. Results： The titer of cDNA library unamplified was 1.32×106pfu/ml， and the titer of cDNA library amplified was 1.65×1010pfu/ml .The recombinant rate of cDNA library amplified was 90.6%. We finally got 360 sequences whose length were between 300bp and 110bp， and the average length was 606bp. 201 Gene information with annotation（BLAST） was distributed on 27 pathways（PANTHER）， including TXN， MDH1， ARL1， ARPC3， ACTG1 and many other genes which were separately distributed on pathways associated with metabolism， Oxidative stress， or Cardiovascular system function. So we speculate that it may be related to physical ability. GO was used to analysis and classify gene sequences， and then 143 Genes with functional annotation in the database were confirmed to participate in different functions which mainly include cellular component， molecular function and biological process. Conclusions： This study has successfully constructed a full-length athletes' cDNA library which conformed to the standard of cDNA library construction.
Keywords： half-pipe snowboarding； Lymphocyte； full-Length cDNA Library； expressed sequence tags
单板U型场地滑雪于1998年日本长野冬奥会上被设为正式比赛项目[1 ]。研究表明，该项目在完成整套动作中无氧供能占比例较大，但在高山环境中重复的训练及漫长的赛季使得该项目运动员同样需要进行大量的有氧耐力训练 [2-3]。由于该项目开展时间较短，有关的科学研究数量有限，主要集中在生物学监控、技术动作分析、运动损伤与心理调控等方面，其他领域多为空白。近年来有研究表明，遗传因素在个体间运动能力的差异方面起较大作用。随着分子生物学研究的深入，大量与运动能力相关的基因被发掘出来，通过生物技术手段对运动员进行研究已成为了当今研究的热点 [4]。对新兴的该项目而言，为持久深入了解运动员遗传信息在其表达调控过程中所起的作用，势必面临运动员遗传资源有限与持续的功能基因研究间的矛盾问题，鉴于此原因，构建cDNA文库则成为解决这一矛盾的首选，更为我国2022年北京冬季奥林匹克运动会的备战起到重要作用。
本研究选择SMART技术构建单板滑雪运动员cDNA文库优势在于减少了起始阶段RNA的用量便可获得比例较高的全长cDNA，且实验过程快速简单 [5]。
1 实验材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象
无菌采集优秀单板滑雪运动员静脉血，所有标本均在运动员知情同意的条件下采集。本研究样品来源于2010/2011年LG国际雪联单板滑雪世界杯赛中国国家队全体男子运动员，共记13名，均参加过国际比赛或在全国锦标赛上取得过名次，符合优秀冰雪运动员特征标准，具体信息见表1。
1.1.2 主要试剂
Trizol购自Invitrogen；SMARTTM cDNA Library Construction Kit购自Clontech；Gigapack Ⅲ Gold-7购自Stratagene，其他试剂为分子生物学实验室常用试剂。
1.2 试验方法
1.2.1 总RNA提取
抽取运动员新鲜静脉血，随后用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，经细胞计数约3×106个细胞加入1 mL Trizol，混匀后室温静置使其充分裂解，对其进行抽提，混合总RNA，将所有总RNA溶于无Rnase的DEPC处理过的水中，紫外分光光度计测定OD260/OD280，提取总RNA的浓度与纯度，随后进行甲醛变性电泳检测总RNA的降解情况。
1.2.2 cDNA文库构建
在运动员外周血淋巴细胞cDNA文库的构建中ss-cDNA和ds-cDNA 的合成利用SMART cDNA Library Construction Kit，取2 μg总RNA为模板，按试剂盒说明书方法反转录合成cDNA第一链，经LD-PCR合成ds-cDNA，产物进行琼脂糖凝胶电泳检测cDNA合成结果。随后对经检测符合要求的ds-cDNA依次进行蛋白酶K处理和SfiI酶切消化，利用spin-400纯化柱进行分级纯化，收集含有cDNA的样品与λTriplEx2载体16 ℃连接过夜，将连接产物用Gigapack Ⅲ packing extract包装，得到未扩增文库。
1.2.3 文库的扩增
培养VCS257菌液，离心后用10 mol/L MgSO4调OD值为4.0，加入500 μL的^夜菌和足够形成6～7×104个噬菌斑的包装产物，将菌液与包装产物混合液于37 ℃孵育15 min；立即加入LB顶层胶，颠倒混匀并倒入已经准备好的LB固体培养基中；37 ℃孵育过夜直至噬菌斑相互接触；随后在平皿中加入SM buffer4 ℃过夜并洗脱表面噬菌斑将其收集纯化，从而得到扩增后的cDNA文库，扩增文库在4 ℃可以保存6个月，长期保存时需加入7%的DMSO以每管1 mL分装于-70 ℃保存，且避免反复冻融。
1.2.4 文库滴度测定
培养VCS257菌液，离心后用10 mol/L MgSO4调OD值为4.0，随后稀释包装产物，未扩增文库按1∶10 和1∶20稀释，扩增后文库按1∶5 000和1∶10 000稀释；取1 μL稀释后的包装产物加到菌液中；将菌液与包装产物混合37 ℃孵育15 min；加入LB顶层胶颠倒混匀，并立即倒入已经准备好的LB固体培养基中；37 ℃孵育过夜；查找噬菌斑个数，通过文库克隆数量滴度计算公式：Pfu/mL=（噬菌斑个数×稀释倍数×103）/铺板的稀释噬菌体体积（μL）来推断未扩增文库滴度。
1.2.5 确定重组克隆的百分比
利用X-Gal显色原理，在混有IPTG和X-gal及VCS257菌液的顶层胶的LB/MgSO4的平皿上进行蓝白斑筛选，以此检测未扩增文库的重组率。37 ℃培养8～18 h，通过白色（重组体）和蓝色（非重组体）来推断cDNA文库的重组率，重组率=重组体/总克隆×100%。
1.2.6 PCR检测插入片段
随机挑选96个噬菌斑样品加入到96孔培养板中，每孔加入100 μL的SM缓冲液孵育扩增。取1 μL作为模板，以检测引物cDNAF：CCATTGTGTTGGTACCCGG；cDNAR：ATACGACTCACTATAGGGCGAATT进行PCR。产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，分析电泳结果用以推断重组率。重组率=阳性克隆检出数/测定样品数。
1.2.7 ests获取
为了在所构建的cDNA文库中识别和分析更多转录本的功能，随机挑选500个噬菌斑作为模板进行PCR，产物提交至北京诺赛基因组研究中心有限公司，利用ABI3730基因分析仪对待测的500个样品PCR产物以5’端开始进行单项测序（测序引物序列5’sequencing primer： CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT）。
1.2.8 ESTs分析
利用Chromas软件将测序结果中的空载、信号质量杂乱以及小于l00 bp的序列去除，获得单拷贝EST，将这些ESTs提交至NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），使用GenBank中的BLAST序列比对功能对所测的序列进行相似性检索比对，根据序列的相似性获得最佳匹配效果的基因注释 [6 ]，将匹配的序列通过GO（http：//.cn）与PANTHER（http：//）进行相关基因功能归类及分析 [7-8 ]。
2 结果
2.1 总RNA样品检测
提取的总RNA用分光光度计进行检测，OD260/OD280的比值为1.98，表明所提取的RNA没有被DNA，蛋白和其他杂质污染。样品浓度约为3 650 ng/uL。甲醛变性凝胶电泳检测得到的电泳图上能观察到清晰的28 S核糖体RNA与18SRNA及5 S核糖体三条带，如图1所示。28 S和18 S两条带的灰度值比约为2：1，由此表明，RNA降解较少，保存较为完整，可用于后续文库的构建工作。
2.2 LD-PCR合成双链cDNA
通过反转录和LD-PCR来合成全长双链cDNA，经1.1%琼脂糖凝胶电泳检测，ds-cDNA应分布在0.1～4 kb，如图2所示，由此证明合成的cDNA双链覆盖的范围很大，基因种类丰富。
2.3 大片段cDNA分离处理
利用CHROMA SPIN-400 column分离纯化不同大小的cDN段，得到400 bp以上的片段可用于后续连接载体使用。
2.4 cDNA文库特征
未扩增的文库和扩增后的文库滴度分别是：1.32×106 pfu/mL和1.65×1010 pfu/mL。通过PCR技术检测插入片段的比率和插入片段的平均长度，扩增后文库的重组率约为90.6%，插入片段在100～1 100 bp，如图3所示。这些结果表明，插入片段包含大部分的cDN段，符合一个标准文库构建的要求，对进一步研究基因结构、翻译和表达提供了必要的条件。
2.5 ESTs的生成
为了获得更多运动员外周血淋巴细胞中ESTs功能性基因的信息，在本研究中，我们共对500个克隆进行测序，去除空载及结果在300 bp以下低质量序列后，得到有效EST序列360个，其核苷酸片段大小分别从300～1 100 bp不等，平均长度606 bp，如图4所示。
2.6 GO分析
根据GO检索出该数据库中的功能基因143个，参与31项生物功能，GO分析的结果主要分3类。根据图5可以很清晰地观测到，在GO分类分析结果中与细胞组成方面相关的生物学功能9个，与分子功能方面相关8个，与生物过程方面相关的注释数量有14个，分别占29.0%、25.5%和45.5%。GO分析可反映同一基因具有的不同分子功能，同时也参与不同的生物学过程，从而反映生命过程的复杂性。
2.7 Pathway分析
将BLAST比对后具有注释的基因进行PANTHER检索，在该数据库中有201个与本次提交信息相关的基因信息，这201个功能被发现参与27个相关的代谢途径，其中占比率较高的分别为：整合素信号通路（Integrin signalling pathway）、趋化因子和细胞因子介导的炎症反应信号通路（Inflammation mediated by chemokine and cytokine signaling pathway）、Rho GTPase调节细胞骨架（Cytoskeletal regulation by Rho GTPase）、钙粘着蛋白信号通路（Cadherin signaling pathway），而其中氧化应激反应（Oxidative stress response）、三羧酸循环（TCA cycle）和HIF激活缺氧反应（Hypoxia response via HIF activation）等通路由于与新陈代谢、氧化应激反应、心血管系统机能相关联，推测可能与该项目运动存在关联，如图6所示。
3 讨论
以往研究表明，cDNA文库的构建是功能基因组分析不可缺的工具，可为生物体内基因组机制多样化过程提供更多的详细信息，随着科技的进步，cDNA文库的构建技术已日趋成熟，并在农业、生物、医学等领域取得了一批珍贵的研究成果，但在体育领域至今仍无人问津。通过构建cDNA文库不仅可有效保存优秀运动员遗传资源，分离全长功能基因，还可以从转录水应运动员特定时期功能基因在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老等生命现象的研究过程中起到重要作用，具有更为广泛的应用价值[9]。由于cDNA便于克隆和表达，从cDNA文库中筛选得出的目的基因可直接用于该基因的表达，是研究工作中最常使用到的表达基因文库[10]。
已有研究表明，鉴定cDNA文库的质量需从3个方面进行：首先根据Clareke公式计算，cDNA 文库应包含至少1.7×105独立克隆来_保99%低丰度mRNA会呈现在库中；其次是插入基因长度应在0.1 kb以上，确保cDNA的富集与完整，最后重组率应达到90%以上，同样作为一个评价文库质量的重要指标[4-12]。在本研究中，我们得到未扩增与扩增后滴度分别为1.32×106 pfu/mL和1.65×1010 pfu/mL，插入片段在100～1 100 bp且重组率为90.6%的运动员cDNA文库，表明该文库质量良好，可为该项目运动员在转录水平的深入研究提供物质基础。另有研究表明，对于EST分析等功能基因组学的研究而言，大于300 bp的核苷酸序列即可以代表基因信息[13]；所以在对随机挑选的500个克隆进行测序后除去小于300 bp的序列，余下的360个序列长度分别从300～1 100 bp不等，平均长度为606 bp，从而进一步表明所建文库效果较好。因此，本研究构建的文库可以用于EST测序。在本文中我们所构建的单板U型场地技巧运动员全长cDNA文库符合标准库的要求。
20世o末Adams等[14]提出了ESTs的概念，通过构建cDNA文库可以从中大规模获得ESTs用于基因的共功能性研究，在本研究通过测序比对得到201个具有功能注释的基因，参与27个相关的代谢途径，其中占比率较高的如前所述。通过查询发现文库中所得基因TXN、MDH1、ARL1、ARPC3、ACTG1等分别在这些pathway上被注释，从而推断可能参与与运动能力相关的机能。利用GO对所测ESTs进行归类得到具有功能注释的基因143个，参与31项不同功能，大多与蛋白质调节活动和新陈代谢相关，主要包括细胞组分、分子功能和生物过程，在各功能归类中细胞组成反映了基本功能基础，分子功能反应是一个单独的基因产物的功能，而生物学过程则综合反映各生命活动过程的复杂性。通过对所获得的ESTs信息注释归类，从而获得更多与身体机能及运动能力相关的信息为后续对该项目运动员相关机能的研究提供依据。
目前研究表明，从文库中选择单克隆进行ESTs测序，已被证明是一种快速高效的用以评估cDNA文库质量的检测方法[15]。通过计算某一基因片段在EST文库中出现的频率，就可以确定基因表达的差异，随着越来越多物种全基因组测序的完成，ESTs数据迅速增加，许多通过分析公共数据库中EST来鉴定cDNA文库间基因差异表达的网络资源也发展起来，用EST序列分析来研究基因表达显示良好的前景[15]。
早在1997年由McPherron等[16]在对小鼠肌肉cDNA文库进行筛选时发现Myostatin（MSTN）基因，继而鉴定出MSTN基因可强有力地负向调控骨骼肌的生长发育和使肌肉力量的增加，为人类后期从文库中筛选与肌肉力量相关基因提供可行性依据。本实验中，由于外周血淋巴细胞取材便捷且携带大量遗传信息，所以成为实验取材的首选。据以往研究表明，人类淋巴细胞基因表达谱与多种疾病相关，是一个重要的研究领域，淋巴细胞是免疫活性细胞，分泌白细胞介素等多种重要的细胞因子，其中表达的基因不仅与免疫功能有关，而且与细胞信号转导、生长发育、血细胞、神经细胞再生等有密切的关系，所以在后续研究中有着广泛的应用价值[17]。在本研究中，我们构建运动员外周血淋巴细胞cDNA文库，旨在批量保存优秀运动员功能性基因的基础上分离出大量的ESTs，以此推断这些基因是否与某种运动能力存在相关联系，同时也为以淋巴细胞基因表达谱研究运动员神经系统，在相关基因的调控过程中所起的重要作用提供了更为便捷的途径，因此，构建运动员外周血淋巴细胞cDNA文库具有广泛的应用价值。
4 结论
单板U型场地雪上技巧作为一项开展不久的运动项目，相关的科学研究目前十分有限，本研究通过构建cDNA文库，以基因组的形式对此类运动员遗传信息进行永久保存，解决以往实验研究的接力式进行与标本的暂时性采集中存在的矛盾，以便有效地对同一研究对象进行持久的连续性研究，为日后深入探索该项目运动员遗传及发育特点提供可持续利用资源，此外，本研究结合测序技术得到大量的ESTs，从中筛选出相关基因，推测其可能与运动能力存在联系，更是为备战2022年我国冬季奥林匹克运动会前运动员的科学选材、运动基因的筛选及基因功能研究提供了一种新的思路与方法，对运动科学更好地开展起着促进作用。
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