巨噬细胞在损伤时间推断中的作用

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【摘要】 损伤时间推断，一直是法医病理学领域中研究的重要课题。为了寻找准确推断损伤时间的方法，本文综述了巨噬细胞在损伤修复过程中的作用机理、伤后巨噬细胞源性细胞因子的表达和巨噬细胞吞噬物的演化与损伤时间的关系。认为进一步研究巨噬细胞在损伤修复中的特征性变化，有望成为推断损伤时间的新方法之一。

【关键词】 法医病理学；巨噬细胞；损伤修复；损伤时间推断

The role of macrophages in wound age estimation during the wound healing process

【Abstract】 Dating of injures is always an important hot topic in the field of forensic medicine.To seek a method to estimate exact dating of injury，this article reviewed the mechanism of macrophage during the repair of injury，the expression of cytokines derived from macrophages after injury and the relation between the changes of phagosomes in macrophages and the dating of injury.It is suggested that some characteristic changes of macrophage during the repair of injury could be one of new ways for dating of injures.

【Key words】 forensic pathology; macrophage ；repair of injures；wound age estimation

为了寻找准确推断损伤时间的方法，现把巨噬细胞在损伤时间推断中的作用综述如下。

1 损伤修复的病理生理学概况

损伤造成机体部分细胞和组织丧失后，机体对所形成缺损进行修补恢复的过程，称为修复。当机体细胞受到损伤因素的刺激后，可释放多种生长因子，刺激同类细胞或同一胚层发育来的细胞增生，促进修复过程。尽管有许多化学介质都可影响细胞的再生与分化，但以多肽类生长因子最为关键，它们除刺激细胞的增殖外，还参与损失组织的重建。有些生长因子可作用于多种类型的细胞，而有些生长因子只作用于特定的靶细胞。参与损伤修复过程比较重要的生长因子有血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、具有刺激生长作用的其他细胞因子如白细胞介素（ IL ）和肿瘤坏死因子(TNF)等［1］。

2 巨噬细胞与损伤时间的关系

在机体创伤修复过程中，巨噬细胞主要有两方面的作用。其一，一旦机体创伤活动开始，巨噬细胞就能大量分泌多种生物活性物质以及多种酶类物质，其中生物活性物质又称巨噬细胞源性生物因子，包括多肽转换生长因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、血小板衍生生长因子以及一氧化氮等；酶类物质主要包括胶原酶、弹性蛋白酶、纤溶酶原激活剂等；这些生物活性物质直接引导着机体修复的整个进程。其二，巨噬细胞作为炎症阶段的主要吞噬细胞，负责清除机体损伤处组织和细胞的坏死碎片以及病原体等，这些物质对创伤愈合过程都有重要的调控作用。因此，研究创伤修复过程中巨噬细胞释放的细胞因子的种类和含量在创伤后不同时间的变化规律，将可能从分子水平和细胞水平上提供一些与损伤时间相关的标志性变化或依据；而文献报道巨噬细胞吞噬物的变化亦具有与时间相关的特点，巨噬细胞吞噬物在形态上易于观察和检测，这些特征使得巨噬细胞在损伤时间推断过程中具有重要的法医学意义。

2.1 巨噬细胞源性细胞因子与损伤时间的关系 创伤修复是一个在时间和空间上受一定的细胞生物因子所调控的复杂生物学过程，其中巨噬细胞分泌的细胞因子在创伤修复中的活跃表达近年来已被中外学者所关注，一些已考虑作为损伤时间推断的有用参数［2～4］。目前认为主要参与损伤修复的巨噬细胞源性细胞因子有以下几种。

2.1.1 转化生长因子（Transforming Growth Factor-β，TGF-β） TGF-β是一种具有广泛生物学效应的多肽细胞因子，来源于血小板、巨噬细胞、T淋巴细胞、增殖的上皮细胞、成纤维细胞等，参与细胞的增殖分化、代谢和内外间质的形成，在组织创伤、修复、炎症、骨质再生、肿瘤发生等病理生理过程中起重要作用；TGF-β还是一种极强的免疫调节剂，能抑制多种免疫反应，对单核巨噬细胞等炎性细胞具有极强的趋化性。TGF-β通过调节细胞周期因子、转录因子、生长因子、粘附分子和细胞基质基因的启动、转录、降解等环节而实现其促进或抑制细胞生长的功能创缘组织表达。而且TGF-β能诱导中性粒细胞和巨噬细胞向创伤部位补充，促进成纤维细胞增殖和细胞基质的合成，并能促进表皮细胞的增殖。TGF-β是再生上皮化的重要标志，是皮肤基质和肉芽组织形成的重要且必不可少的条件，已证实它能影响愈合过程的各个阶段，提供正常愈合的信号物质，其中TGF-β与创伤关系最为密切［5，6］。此外，TGF-β还促进成纤维细胞趋化，产生胶原和纤维连接蛋白，抑制胶原降解，促进纤维化发生［1］。谢举临等［1，7，8］认为TGF-β是创伤修复过程中促进切创愈合的一类强有力的细胞因子，它的表达异常直接影响伤口愈合的时间。

王慧君等［9］研究大鼠皮肤切创处的TGF-β时，发现参与早期（约伤后0.5h）的一过性表达的TGF-β主要源于损伤的表皮、局部的出血和渗出液，持续一段时间后由于快反应基因及其基因产物的表达已经完结，而肉芽组织尚未形成，渗出的炎性细胞产生新的来源尚未达到足够的浓度，因此出现了一个暂时的表达降低，而随后由于大量炎性细胞渗出，肉芽组织形成携带大量巨噬细胞及成纤维细胞，使TGF-β有了新的来源，加之上述因子及其他因子的调节作用又促使上皮组织增生及表达大量的TGF-β因而使TGF-β的m RNA及其蛋白产物表达增多，出现反弹性升高，随着修复组织内出现大量巨噬细胞、活跃增生上皮及成纤维细胞参与调节和表达TGF-β，使TGF-β基因及其产物的表达在96h达到峰值。Betz P ［10］等通过标记不同修复时期的巨噬细胞类型，并标记出不同损伤时间的TGF-β含量变化且已成功的用于推断损伤时间。Beck LS等 ［5］证实，创缘组织表达TGF-β是再上皮化的重要标志，是皮肤基质和肉芽组织形成的重要且必不可少的条件，它能影响愈合过程的各个阶段，提供正常愈合的信号物质，其中以TGF-β1与创伤关系最为密切。有研究［11］提示TGF-β是创伤修复后期主要的细胞因子，TGF-β在修复过程中的一些规律性变化及特点反映了与损伤时间的关系，可作为精确推断损伤时间的分子生物学标志。

2.1.2 白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1) IL-1是介导急性期反应最重要的细胞因子之一。持续感染时IL-1能促进集落刺激因子的产生，引起骨髓造血前体细胞的增殖。IL-1由激活的单核巨噬细胞产生，人的IL-1由不同cDNA的IL-l 和IL-lβ组成。以往的研究表明，IL-1对促进创面肉芽组织中的血管生成有显著作用，局部应用IL-1能使肉芽组织中新生血管的出现提前4～6天。另外，IL-1能刺激成纤维细胞增殖，促进胶原、胶原酶和透明质酸的合成，也是促进创伤修复的机制之一。Kondo T等［12］研究表明，IL-lβ的动态变化和TNF-α相似，而IL-l 则于伤后6h达高峰，72h再一次升高，在大鼠腹膜手术后不同时间点收集伤口渗出液中的巨噬细胞，腹腔灌洗液中的巨噬细胞数随术后时间而增加，于术后3天达峰值。据此认为IL-1主要在腹膜修复的晚期而不是早期发挥作用，这可能与促进成纤维细胞的增殖有关。

2.1.3 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF） TNF是一种糖蛋白的低聚物，其分子量有很大差异。天然的TNF有二聚体、三聚体或五聚体等多种形式。巨噬细胞是产生TNF的主要细胞，机体不同部位的巨噬细胞受各种刺激后都有产生TNF的能力。低浓度时，TNF能促进肉芽组织的生长，主要表现为诱导毛细血管的生成，此外对肉芽组织中的RNA以及DNA有一定的作用。

国内外学者曾用不同方法检测各种标本损伤状态下的TNF的含量随时间的变化，他们几乎都发现了类似的规律性变化。Kond T［12］等研究发现小鼠皮肤切创愈合过程中TNF-α 含量在损伤后即快速上升，在伤后3h达峰值。而组织学显示伤后 3～6h时，大量中性粒细胞渗出，表明伤口处于急性炎症期；在伤后72h，TNF-α含量再次升高，此时组织学特征为新鲜肉芽组织形成，这表明伤口处于增殖期，此期参与修复的细胞因子主要来源于肉芽组织内的大量成纤维细胞和巨噬细胞。Sato Y［13］等研究小鼠皮肤创伤愈合过程中TNF-mRNA的含量，于伤后48～72h达峰值，240h后基本恢复至正常水平。王勇等［14］研究小鼠伤后不同时点腹腔巨噬细胞TNF-α的分泌量，结果伤后2h即明显升高，6h稍下降，12h达峰值，24h、48h时TNF-α分泌量仍较高，但已呈下降趋势。以上实验表明，TNF-α和创伤修复的炎症期和增殖期关系密切，从法医病理学的角度来看，可以作为损伤时间推断的一个指标。

2.1.4 一氧化氮 （NO） NO主要由内皮细胞、巨噬细胞和一些神经细胞所产生，是在一氧化氮合酶（NOS）激活下产生的。一氧化氮合酶有内皮细胞型（eNOS）、神经元型（nNOS）和细胞因子诱导型（iNOS）三种类型。在正常组织中，一氧化氮酶很少表达，但一旦激活便可大量增加。eNOS和iNOS则是皮肤损伤愈合过程中产生NO的两种关键酶，在皮肤损伤愈合过程中发挥重要作用。近年来大量的研究表明NO在皮肤损伤愈合过程中炎症介导、细胞增殖、分化、凋亡及血管形成、基质沉积和损伤后组织重构中发挥重要作用。NO参与了创伤修复的各个阶段，发挥多种生物学功能，其体内机制目前尚不清楚。Reichner JS等［15］发现在创伤早期，NO主要来自激活的巨噬细胞，损伤后6～24h大多数巨噬细胞表达iNOS，3～5天后有所下降，持续至10天。目前已有许多学者通过检测eNOS和iNOS含量的变化来推断损伤时间。

2.2 巨噬细胞吞噬物与损伤时间的关系 活体组织受损后，局部可发生出血、坏死，巨噬细胞吞噬组织间隙的血细胞和坏死组织后，吞噬物与胞浆内的溶酶体融合，随损伤时间的延长而逐渐降解，不能分解的物质则在胞浆内形成残留物。Betz P等［16］的报道表明，含吞噬物的巨噬细胞如噬脂细胞、噬血红蛋白细胞和噬铁细胞最早在伤后2～3天出现，损伤组织中出现吞噬细胞的时间有部位差别。在人体，脑和皮肤组织出现噬铁细胞的时间于出血后15～17h，而在肺则出现在出血后30min左右。组织内出血时，从血管中逸出的红细胞被巨噬细胞摄入并由其溶酶体降解，使来自红细胞的血红蛋白的Fe3＋与蛋白质合成电镜下可见的铁蛋白微粒，若干铁蛋白微粒聚集成为光镜下可见的棕黄色，较粗大的折光颗粒称为含铁血黄素。巨噬细胞破裂后，此色素也可见于细胞外。含铁血黄素因含Fe3＋而被普鲁氏蓝染成蓝色。Laiho K［17］报道，在人体，损伤出血后21～48h皮肤和皮下出现噬铁细胞，4～8天后则更多。Betz P等［18］通过研究人体皮肤损伤标本认为，含铁血黄素最早于伤后3天检测到，伤后8天则超过显微镜20%的区域均可见含铁血黄素沉积。据此认为只要20%或以上的检测区域检见含铁血黄素沉积，就可认定损伤时间大约为7天。因此，通过图像分析系统检测巨噬细胞吞噬物推断损伤时间有可能成为一种非常简便易行的方法。

3 小结

综上所述，国内外学者对巨噬细胞分泌的细胞因子如TGF、IL、TNF、NO等参与损伤修复过程的发生机制和相关因素作了较多研究，而有关巨噬细胞吞噬物方面的研究较少。有些研究取得了较理想的结果，给今后的研究指明了较明确的方向。但多数研究仅限于动物实验，因种属差异等原因，许多研究是否有实用价值有待于进一步作人体标本的研究。

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