硫酸铍对小鼠体外脾淋巴细胞DNA损伤的剂量效应

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【摘要】 目的：观察不同剂量硫酸铍（BeSO4）在不同时相处理后引发小鼠体外脾淋巴细胞的dna链断裂损伤的剂量效应. 方法：采用单细胞凝胶电泳法(SCGE)分别测定BALB/c小鼠脾淋巴细胞体外染毒0.2, 2, 20, 100和200 μmol/L 1 h和2 h后DNA链断裂损伤情况. 结果：在不同剂量硫酸铍染毒1 h后,脾淋巴细胞出现DNA链断裂损伤的测定指标在各剂量组明显高于对照;染毒1 h 和2 h后,细胞均出现明显的DNA链断裂损伤，但其相同剂量组之间差异无显著性. 结论：硫酸铍可诱发小鼠体外脾淋巴细胞的DNA链断裂损伤.

【关键词】 硫酸铍

0引言

铍（Beryllium）及其化合物具有众多优良的理化性质，被广泛应用于高科技工业领域. 国际癌症研究中心（IARC）最新公布的对人致癌性总评价表中已将铍及其化合物列为人类肯定致癌物［1］. 已知铍及其化合物可损害机体的免疫系统［2-4］. 因此,应用单细胞凝胶电泳（SCGE）法检测，以判断硫酸铍导致脾淋巴细胞功能异常是否由于DNA 断裂损伤所致,对于探讨铍免疫毒性作用机制具有重要意义.

1材料和方法

1.1材料BALB/c小鼠, 雄性， 体质量(20±2) g, 6～8 wk龄,二级动物,宁夏医学院实验动物中心提供. 硫酸铍（BeSO4·4H2O, Sigma?Aldrich公司); 胎牛血清(Hyclone公司); RPMI 1640 (Gibco公司); 低熔点琼脂糖(Sigma公司); 正常熔点琼脂糖(Sigma公司); 肌氨酸钠(Promega公司); Tris Base (NOVEN公司); 碘化丙锭（PI, Sigma公司); 二甲基亚砜（DMSO, 北京化工厂); TritonX?100 (Sigma公司); 甲醛(北京化工厂)； EDTA(天津化学试剂厂); 全磨沙载玻片；恒温水浴箱(北京医疗设备厂); 荧光显微镜(CK X41, Olympus); 稳压稳流电泳仪(BIO?RAD; 水平式凝胶电泳槽(DYY?Ⅲ 33A型, 北京六一仪器厂).

1.2方法

1.2.1脾淋巴细胞悬液的制备常规无菌取脾,用注射器内芯加Hank?s (pH 7.4, 4℃) 研磨,200目筛网过滤,用RPMI 1640完全培养液将其稀释成1×108个/L细胞悬液［5］.

1.2.2细胞染毒分别取脾淋巴细胞6份于试管中, 1管加完全培养基作阴性对照,其余5管各加入不同浓度的BeSO4溶液,使终浓度分别为0.2, 2.0, 20.0, 100.0, 200.0 μmol/L,置37℃恒温水浴振荡器孵育1 h;同样设6管同上染毒2 h后检测. 染毒完毕后用台盼蓝染色观察染毒后的细胞存活率大于90%.

1.2.3DNA链损伤的检测参照Singh法［6］, ①制片： 分别取125 mg低溶点琼脂糖（LMA）和正常溶点琼脂糖（NMA）溶于25 mL无Ca2+, Mg2+磷酸缓冲液（PBS）中，制备成5 g/L LMA和5 g/L NMA. 在56℃下，将100 μL 5 g/L NMA浇注到全磨砂载玻片上，盖上盖玻片置4℃，10 min使琼脂糖固化. 在37℃下，将50 μL细胞悬液与50 μL 10 g/L新鲜配制的LMA混匀，4℃固化；再取75 mL 5 g/L LMA铺至第二层琼脂糖上，置4℃，10 min固化;②裂解、解旋、中和：将载玻片浸入4℃冷裂解液（2.5 mol/L NaCl; 100 mmol/L EDTA; 10 mmol/L Tris）中裂解1 h，电泳缓冲液中避光放置 20 min；25 V， 300 mA电泳20 min，Tris?HCl （pH 7.5）中和3次，用50 μL 5 mg/L碘化丙锭（PI）溶液染色; ③分析：荧光显微镜下使用590 nm的绿色激发光进行观察，数码相机拍照，每份样本随机拍摄50个DNA受损细胞，将拍摄的图像输入计算机（图像设置为300×400象素进行分析）， 运用CASP软件计算彗星细胞的尾长、 尾矩、 Olive尾矩及尾部DNA百分含量.

统计学处理： 用SPSS 11.5统计软件包进行方差分析.

2结果

2．1染毒后DNA损伤的“彗星”形态学观察染色后在荧光显微镜察20倍镜下观察可见, 阴性对照组的淋巴细胞大小比较均一，为一圆形荧光团，荧光强度均匀，边缘光滑，即彗星头部，无拖尾现象（图1A）. BeSO4染毒作用时,损伤细胞的DNA迁移表现为彗星头部核心致密、周边松散,呈刷状缘样；并且随着BeSO4剂量的增加，彗星的尾巴加长，尾部的荧光强度增强，彗星头部的直径随着尾部的加长而减小（图1B,C,D,E,F）.A：阴性对照组；B：0.2 μmol/L组；C：2 μmol/L组；D：20 μmol/L组；E：100 μmol/L组；F：200 μmol/L组.

图1硫酸铍致小鼠脾淋巴细胞DNA受损形态　略

2.2染毒不同剂量DNA链损伤的检测BeSO4染毒1 h和2 h时所致DNA链损伤出现的尾长及尾矩与对照组相比 ,各剂量组显著增加(P<0.01)，彗星尾部DNA百分含量随着BeSO4剂量的增加而增加.

2.3染毒不同时间DNA链损伤的检测各剂量组尾长尾矩及尾部DNA百分含量在染毒2 h组与阴性对照组相比显著增加(P<0.01)，且均高于染毒1 h组,但无统计学意义(P>0.05, 表1) .

表1硫酸铍致小鼠脾淋巴细胞DNA损伤的指标（略）

3讨论

铍及其化合物是一种严重危害人类健康的金属污染物，人类对其研究已有几十年，但至今有关它的毒作用机制尚未清楚. 已知铍及其化合物可损害机体的免疫系统,但是否是由于DNA的损伤而导致淋巴细胞功能异常，国内外未见相关报道. SCGE是在单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤和修复的分子生物学毒性评价方法. DNA的损伤和肿瘤的发生有一定的关系,由于SCGE对低水平的DNA损伤极为敏感,因此可用于人类遗传损伤的生物监测,特别是作为职业有害因素对健康影响的早期监测指标具有很好的应用前景. 通常情况下，DNA双链以组蛋白为核心盘旋形成核小体，在核小体中DNA为负超螺旋结构，如果有去污剂进入细胞，白被浓盐提取，DNA便形成残留的类核. 如果类核中DNA断裂，就会在核外形成一个DNA晕轮，DNA断裂将引起超螺旋松散，电泳时DNA断片向阳极伸展，形成特征性的彗星尾. DNA受损越严重，含断裂片段越多，彗星尾就越长，尾中DNA百分含量和尾长就成了DNA断裂的重要指标. 对于DNA损伤的彗星图像分析，目前国内主要采用肉眼观察测定尾长及人工判断DNA损伤程度，由于各实验室条件不同，操作人员对细胞DNA损伤判断标准不统一，因此主观性强，精确度不够. 我们采用国外CASP彗星图像分析软件，综合考虑形状、距离、强度、矩类四方面后选择分析了彗星尾部DNA百分含量、彗星尾长、尾矩和Olive尾矩4个指标，不仅省时省力，而且直观、准确［7］. 淋巴细胞被体外染毒硫酸铍1 h, 0. 2 μmol/ L时就导致靶细胞的DNA损伤,且与其浓度呈明显的剂量效应关系;随着染毒作用时间的增加,DNA链损伤略有加重,但未见时间效应关系. 硫酸铍在低浓度下对淋巴细胞具有刺激作用. 我们在细胞毒性试验基础上选择对细胞无明显毒性的浓度作为最高受试浓度进行SCGE试验, 结果表明, 0.2～200 μmol/L的硫酸铍均能在体外引起小鼠脾淋巴细胞DNA损伤, 且呈明显的剂量? 效应关系. 本实验结果提示, 低浓度硫酸铍尽管未对细胞存活率产生明显毒性, 但可导致DNA损伤. 在硫酸铍毒性作用发生过程中, DNA损伤可能起着非常重要的作用. 可以推测, 正是由于DNA损伤, 导致淋巴细胞免疫功能的异常, 进而影响机体的免疫功能, 但目前尚缺乏更多、更直接的证据, 有关这一方面尚待进一步研究.

【参考文献】

［1］ 江刚. 美国国家毒物学办公室把铍及其化合物列为人类致癌物［J］.中国环境科学, 2000,20:206.

［2］ Reeves AL. The immunotoxicity of beryllium［J］. Immunotoxicology, 1983:261-266.

［3］ 李学军. 慢性铍病发生的免疫病理机制［J］. 职业卫生与病伤,1995, 10(2):110-113.

［4］ 刘海滨. 铍病发病机制和诊断的研究进展［J］.工业卫生和职业病,1997,23(4):241-243.

［5］ 段链,杨静玉,于海,等.彗星试验中全血法与分离淋巴细胞法的比较［J］.癌变畸变突变,2004, 16(5):307-309.

［6］ Signh NP, Mccoy MT, Tice RR, et al. A simple technique for quantitation of low level of DNA damage in individual cell［J］. Exp Cell Res,1988,175:184-186.

［7］ 乔琰,鲁志松，姚汉超,等. 彗星试验分析指标的进展和应用［J］.卫生毒理学杂志,2004,18(3):190-193.