Mucin—4在百里醌抑制肝癌生长中的作用
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[摘要] 目的 探讨百里醌对体内外肝癌生长的影响，并对其机制进行初步探讨。 方法 不同浓度百里醌作用人肝癌细胞株SMMC-7721后，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测其对细胞生长的抑制作用；Hoechst染色后荧光显微镜下观察细胞形态学变化；RT-PCR检测mucin-4 mRNA在SMMC-7721细胞中的表达；Western blotting检测肝癌细胞中Mucin-4蛋白表达；建立裸鼠肝癌皮下移植模型，完全随机法分为对照组和低（10 μmol/L）、中（20 μmol/L）、高剂量（40 μmol/L）百里醌组，观察不同剂量百里醌对裸鼠肝癌皮下移植瘤生长的影响；免疫组织化学法检测肿瘤组织中Mucin-4的阳性表达。 结果 不同浓度（10、20、40 μmol/L）百里醌作用人肝癌SMMC-7721 24 h后，细胞存活率分别为（80.14±9.84）%、（71.68±6.51）%和（64.58±5.24）%；百里醌作用后，SMMC-7721细胞出现典型凋亡形态学改变；百里醌干预后SMMC-7721细胞中Mucin-4蛋白和mRNA的表达均明显下调，呈浓度依赖性；实验结束后，对照组和低、中、高剂量百里醌组肿瘤体积分别为（1056.3±236.3）、（672.3±178.8）、（529.4±165.7）、（473.1±141.5） mm2，各百里醌组肿瘤体积明显低于对照组（P
[关键词] 肝癌；百里醌；Mucin-4
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）11（a）-0010-04
The role of Mucin-4 in the anti-tumor effect of thymoquinone on liver cancer
TANG Zhen
Yueyang Hospital，the Medical College of Xiangya，the Central South University，Yueyang 414000，China
[Abstract] Objective To investigate the effect and the mechanism of thymoquinone in the growth inhibition of liver cancer.Methods The human liver cancer cell line SMMC-7721 was treated with different concentrations of thymoquinone，the cellular proliferation was assessed by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） method.SMMC-7721 cells morphological changes were observed under the fluorescence microscopy after Hoechst staining.The expression of Mucin-4 mRNA was detected by RT-PCR.Western blotting was used to detect the expression of Mucin-4 in liver cancer cells.Furthermore，human liver cancer model was set up by using SMMC-7721 cells.While the tumors grew with diameter of approximate 3 mm，mice were randomized into the control group，low dose thymoquinone group，middle dose thymoquinone group，high dose thymoquinone group.All treatment lasted for three weeks，thrice per week.Six weeks after implantation，tumor weight and inhibition rate was evaluated respectively after the mice were sacrificed.Immunohistochemistry was used to detect the positive expression of Mucin-4 in the tumors.Results The survival rate of cells after different dose （10，20，40 μmol/L） of human liver cancer cell line SMMC-7721 was （80.14±9.84）%，（71.68±6.51）% and （64.58±5.24）% respectively.Thymoquinone caused nuclear condensation and chromatin margination in SMMC-7721 cells.The expression of Mucin-4 protein and mRNA was down-regulated in SMMC-7721 cells after treatment of thymoquinone.After the study，the tumor volume of the control group，low dose thymoquinone group，middle dose thymoquinone group and high dose thymoquinone group was （1056.3±236.3），（672.3±178.8），（529.4±165.7），（473.1±141.5） mm2 respectively，the thymoquinone group was less than that of the control group obviously （P
[Key words] Liver cancer；Thymoquinone；Mucin-4
肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，全球癌死亡率排第3位，预后差，死亡率高，严重危害人类的健康和生命[1]。目前肝癌治疗的方法主要是手术治疗，而外科手术对早期实体瘤的患者较为有效，对复发、晚期及微小病灶的患者则达不到根治的目的，目前仍以化疗为主，但当前治疗肝癌的传统化疗药物存在疗效低、毒副作用大等缺点[2]。因此，找到疗效较佳且不良反应较低的药物成为肝癌治疗研究的重点与热点。百里醌是由一种生长于地中海和印度边界地带的草本植物——黑种草籽中提取出来的具有生物活性成分的单体，已有大量动物试验研究表明它的抗癌效果显著，目前已将其用于临床Ⅰ期试验[3-6]。迄今为止，临床中对于百里醌在肝癌患者癌细胞控制中的研究还相对缺乏，故认为对其进行研究极为重要，以为其临床应用提供依据。
1 资料与方法
1.1 细胞培养及计算方法
将实验细胞培养于10%的胎牛血清（美国Gibco公司，批号117573600）中，温度保持在37℃，二氧化碳浓度为5%。另以四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法进行细胞增殖方面的检测，主要为将对数生长期为SMMC-7721的细胞进行单细胞悬液的制作，其中培养基为RMPI-1640培养基（美国Gibco公司，批号：11650620），采用96孔培养板进行制作，以200 μl/孔加入，然后将10、20、40 μmol/L的百里醌（美国Sigma公司，批号：87126）加入，注意加入时机为细胞完全贴壁后方可加入，另外注意设定空白调零孔，仅将其加入1%的乙醇，而空白对照组则在加入细胞的基础上再加入1%的乙醇，上述指标分别培养24、48、72 h，另外将MTT液加入后，再静置4.0 h后结束培养，然后以二甲基亚砜（DMSO）加入，并轻微震荡10 min，然后进行相应检测及光密度（OD）值检测，同时观察及计算每个培养基的细胞存活情况。其中细胞存活率的计算方式为（实验组OD值-空白调零组OD值）/（对照组OD值-空白调零组OD值）×100%。
1.2 荧光显微镜下观察细胞形态变化
对数生长期SMMC-7721细胞经不同浓度百里醌（10、20、40 μmol/L）作用24 h，吸弃培养液后用PBS洗2次，加入40 g/L多聚甲醛液固定10 min；吸去固定液，以蒸馏水清洗1次，用Hoechst 33258染色液（5 mg/L）染色10 min；再用蒸馏水清洗2次后，自然干燥后，在荧光显微镜下以340 nm激发光观察并随机拍照。
1.3 RT-PCR检测
SMMC-7721细胞中Mucin-4 mRNA的表达：不同浓度百里醌（10，20，40 μmol/L）作用SMMC-7721细胞24 h；后，将其进行总RNA的提取，严格按照Trizol试剂相关说明书进行提取，并在260 nm及280 nm下进行检测，以PCR扩增法进行检测，其中引物设计为，Mucin-4上游引物：5′-GATTCAAATTCAGATGGGAGCAA-3′，下游引物：5′-CGTCCCGAATCGAAAGACCA-3′（235 bp）；GAPDH上游引物：5′-GTCGAATCCACGAAACTAC-3′，下游引物：5′-GCGATCGTCATACTCGTCCT-3′（123 bp）。反应在25 μl体系中进行，反应条件：50℃下30 min逆转录，94℃变性1 min，57℃退火1 min，并于72℃下进行7 min的延伸，然后进行电泳处理，并对其进行分析处理。
1.4 Western blotting检测SMMC-7721细胞中Mucin-4的表达
不同浓度百里醌（10、20、40 μmol/L）作用SMMC-7721细胞24 h后进行电泳凝胶处理，然后将其采用PVDF滤膜进行转移，再将其进行孵育，时间为3.0 h，依次进行显色，然后分析其每个特异条带灰度值数字化，计算蛋白的相对表达量，注意每次均重复3次实验。
1.5 实验方法
实验动物为4～6周龄的BALB/c雌性小鼠，均购自中科院上海实验动物中心，体重18～20 g，平均（19.1±0.5） g，均为健康小鼠，并由专人饲养于温度与湿度严格控制的洁净层流架内。将2×107个SMMC-7721细胞注射于小鼠体内，注射部位为后肢皮下，使之形成肝癌皮质移植瘤模型。待裸鼠皮下移植瘤直径生长至3 mm，将瘤荷裸鼠随机分成4组（n=10）：对照组（1%乙醇0.2 ml，灌胃）、低剂量百里醌组（百里醌10 mg/kg体重，灌胃）、中剂量百里醌组（百里醌20 mg/kg体重，灌胃）和高剂量百里醌组（百里醌40 mg/kg体重，灌胃），每周一、三、六分别给药3次，连续治疗3周，接种7周后将裸鼠处死，进行解剖及计算抑瘤率。抑瘤率=[1-（治疗组开始平均体积-结束平均体积）/（对照组开始平均体积-结束平均体积）]×100%。
1.6 Mucin-4表达的检测
采用免疫组织化学法检测肿瘤组织中Mucin-4的阳性表达，依次进行固定、包埋及切片处理，严格按照相关试剂盒的操作说明进行操作机检测，计数方法采用高倍视野下观察的方法，由资深人员进行计算，随机选择5个视野进行观察，其中以无阳性细胞表示阴性（-），阳性细胞数占总数的10%以下为+，阳性细胞数占总数的10%～50%为++，占总数的50%以上表示+++。
1.7 统计学处理
应用SPSS 13.0统计学软件数据处理，计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，以P
2 结果
2.1 百里醌对体外肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响
肝癌SMMC-7721细胞经百里醌处理后，SMMC-7721细胞增殖速度减缓，细胞数减少，以空白对照作为对照组，其细胞存活率为100%。经低、中、高剂量（10、20、40 μmol/L）百里醌作用24 h后，细胞存活率分别为（80.14±9.84）%、（71.68±6.51）%和（64.58±5.24）%；作用48 h后，细胞存活率分别为（67.24±5.71）%、（61.27±5.67）%和（51.27±5.66）%；作用72 h后，细胞存活率分别为（51.27±5.21）%、（43.18±3.57）%和（40.12±5.27）%。MTT试验结果表明，SMMC-7721细胞经百里醌处理后，生长受到明显抑制，与对照组比较，差异有统计学意义（P
2.2 百里醌作用后SMMC-7721细胞形态的变化
在荧光显微镜下，正常SMMC-7721细胞核呈圆形或椭圆形，染色质均匀分布，少见呈强蓝色荧光的胞核（处于染色体聚集的有丝分裂细胞核呈强蓝色荧光）。SMMC-7721细胞经不同浓度百里醌（10、20、40 μmol/L）作用24 h后，凋亡细胞脱落悬浮于孔板底部，细胞体积缩小，表面出现不规则变化，胞核缩小，染色质浓缩呈斑块状，并呈强蓝色荧光，出现凋亡小体，随着百里醌浓度的增大，出现越来越多的凋亡细胞（图1）。
2.3 百里醌对SMMC-7721细胞中Mucin-4 mRNA表达的影响
百里醌可明显下调SMMC-7721细胞中Mucin-4 mRNA的表达水平，呈浓度依赖性，随着浓度增高成降低趋势，其中10 μmol/L百里醌组为0.82±0.14，20 μmol/L百里醌组为0.67±0.08，40 μmol/L百里醌组为0.51±0.06，均低于对照组的1.00±0.02（P
2.4 百里醌对SMMC-7721细胞中Mucin-4蛋白表达的影响
与对照组比较，百里醌作用肝癌SMMC-7721细胞24 h后，SMMC-7721细胞中Mucin-4蛋白的表达明显下调，呈浓度依赖性，随着浓度增高成降低趋势，其中10 μmol/L百里醌组为0.44±0.06，20 μmol/L百里醌组为0.41±0.05， 40 μmol/L百里醌组为0.21±0.03，均低于对照组的1.00±0.03（P
图3 Western blotting检测不同浓度百里醌对肝癌SMMC-7721
细胞中Mucin-4蛋白表达的影响
以β-actin为内参；1为对照组，2为10 μmol/L百里醌组，3为20 μmol/L百里醌组，4为40 μmol/L百里醌组
2.5 百里醌对裸鼠肝癌皮下移植瘤生长的抑制作用
对照组和百里醌组动物在给药前后各有少量裸鼠出现食欲减退与稀便等不良反应，但出现不良反应者在干预治疗结束后症状随之消失，研究过程中有1只实验裸鼠死亡，在实验6周后实验所得移植瘤体积中，对照组为（1056.3±236.3） mm2，低、中、高剂量百里醌组裸鼠的移植瘤体积分别为（672.3±178.8）、（529.4±165.7）、（473.1±141.5） mm2，各百里醌组肿瘤体积明显低于对照组（P
2..6 百里醌对裸鼠肿瘤组织细胞Mucin-4阳性表达的影响
对Mucin-4的检测结果中，炎性细胞的胞质颜色为棕褐色。结果表明，与对照组比较，各浓度百里醌组中Mucin-4的表达强度明显低于对照组（P
图4 免疫组织化学法检测不同剂量百里醌对裸鼠肝癌皮下移植瘤中Mucin-4蛋白阳性表达的影响（×400）
A为对照组，B为10 μmol/L百里醌组，C为20 μmol/L百里醌组，D为40 μmol/L百里醌组
3 讨论
寻找有效的天然抗肿瘤药物已成为近年来研究的热点之一。近年来研究表明百里醌具有消炎、抗菌等多种药理作用，且其化合物对人体多器官均无明显不良影响[4-5]；在肿瘤领域，研究表明百里醌能抑制多种肿瘤的发生发展，并认为诱导肿瘤细胞凋亡是百里醌抗肿瘤作用的重要环节[3]。本研究以人肝癌细胞株SMMC-7721为研究对象，也观察到有说服力的增殖抑制效应，MTT实验结果表明百里醌可明显抑制SMMC-7721细胞生长，呈明显浓度依赖性；为了进一步探讨百里醌抑制SMMC-7721细胞增殖的方式，本研究利用荧光显微镜观察SMMC-7721细胞经Hochest 33258染色后细胞核形态学变化，Hochest 33258荧光染料可特异性地与DNA结合，对正常细胞、凋亡细胞均能染色，但由于凋亡细胞染色质浓缩与凋亡小体的形成，因为呈致密浓染，而正常细胞则发出均匀荧光，由此可将正常细胞与凋亡细胞区分开来。结果显示，百里醌处理后的细胞，不仅细胞数变少，而且部分细胞染色质凝集呈颗粒团状分布，出现典型凋亡小体，表明百里醌能有效诱导SMMC-7721细胞凋亡。为进一步验证百里醌对肝癌细胞的抑制作用，本文中即对此方面进行观察研究，结果显示百里醌可显著抑制体内肝癌生长，与体外实验结果相吻合，从而进一步验证了百里醌在治疗肝癌中的确切疗效。
临床研究显示，恶性肿瘤细胞的诊断治疗中缺乏敏感性与特异性均较高的指标，而肝癌患者检测指标中同样存在此种问题，故对此方面进行研究分析的价值较高。较多研究显示Mucins家族变异及表达量在恶性肿瘤的生长周期中有着较佳的反应作用，且对于其与免疫监视的逃避有着一定的相关性，故认为其对于恶性肿瘤的检测价值相对较高[7-8]。Mucin-4是在正常细胞检测中缺乏的一类指标，但是其在恶性肿瘤细胞中的表达却明显较高，故认为对此项指标在恶性肿瘤中的检测价值值得进一步地探讨[9-11]。综合这种因素，本研究认为此项指标可能与肝癌的的调控有着较大的相关性，故对本方面也进行了进一步的探讨研究，结果显示，RT-PCR、Western blotting和免疫组织化学法的检测结果均印证了此种猜测，研究结果均显示，Mucin-4在体内外肝癌中呈现出相对较高的表达水平，故认为其与肝癌的相关性极为明显[12-13]。百里醌作用肝癌细胞SMMC-7721后，不仅Mucin-4蛋白的表达显著下调，同时Mucin-4 mRNA的表达也同样呈浓度依赖性下调，与蛋白水平下调相吻合[14]；另外，在体内实验中，本项目也观察到经过百里醌治疗后裸鼠皮下移植瘤组织中Mucin-4蛋白表达显著被抑制，与体外实验结果相契合，这也进一步肯定了Mucin-4的下调与百里醌抑制体内外肝癌的相关性[15]。
综上所述，百里醌在抑制体内外肝癌细胞中发挥着积极的作用，且对调控Mucin-4也发挥着积极的作用，百里醌在肝癌治疗中的效果值得肯定。
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（收稿日期：2013-06-19 本文编辑：郭静娟）