浅谈流感病毒检验
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【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1005-2720(2010)08 - 67 - 01
流行性感冒病毒,简称流感病毒,是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒,在分类学上,流感病毒属于正黏液病毒科,它会造成急性上呼吸道感染,并借由空气迅速的传播,在世界各地常会有周期性的大流行。流行性感冒病毒在免疫力较弱的老人或小孩及一些免疫失调的病人会引起较严重的症状,如肺炎或是心肺衰竭等。病毒最早是在1933年由英国人威尔逊•史密斯(Wilson Smith)发现的,他称为H1N1。H代表血凝素;N代表神经氨酸酶。数字代表不同类型。
1 病毒的核心
病毒的核心包含了存贮病毒信息的遗传物质以及复制这些信息必须的酶。流感病毒的遗传物质是单股负链RNA,简写为ss-RNA,ss-RNA与白 (NP)向结合,缠绕成核糖白体 (RNP),以密度极高的形式存在。除了核糖白体,还有负责RNA转录的RNA多聚酶。
甲型和乙型流感病毒的RNA由8个节段组成,丙型流感病毒则比他们少一个节段,第1、2、3个节段编码的是RNA多聚集酶,第4个节段负责编码血凝素;第5个节段负责编码白,第6个节段编码的是神经氨酸酶;第7个节段编码基质蛋白,第8个节段编码的是一种能起到拼接RNA功能的非结构蛋白,这种蛋白的其他功能尚不得而知。
丙型流感病毒缺少得是第六个节段,其第四节段编码的血凝素可以同时行使神经氨酸酶的功能。
2 样本采集
2.1 采样液Hank平衡盐、细胞培养液、牛肉浸液(小牛肉浸膏l0g、牛血清白蛋白2g,加蒸馏水至400ml、庆大霉素40mg、多粘菌素B0.8mg,过滤除菌)等均可作采样液。
2.2采集鼻咽腔拭子标本(1)咽拭子:用棉签擦拭双侧扁桃体及咽后壁,将棉签头部侵入2～3ml采样液中。(2)鼻咽抽取物:用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插人鼻腔、接通负压,旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液,并用采样液刷洗收集器3次。(3)含漱液:用8～10以采样液漱口。
2.3 收集血清标本血清标本应包括急性期和恢复期双份血清。急性期应在发病7天内采集,恢复期则在发病后2～4周采集。血液标本以2500r/min离心l5min,收集血清,弃血凝块。
2.4标本运送病毒分离标本采集后应立即低温保存,应尽快送至实验室。24～48h内样品可置4℃保存,如48h内未能进行接种,应置-70℃或以下保存。血清标本可在4汇存放一周,在-20℃长期保存。
2.5 标本处理咽拭子标本,收集管于混合器充分震荡,用无菌镊子取出棉拭子并在管壁上反复挤压棉拭子后弃拭子,标本加入双抗(青霉素、链霉素)终浓度为l000IU/ml,混匀置4℃2h方可接种或低温保存;含漱液标本,混匀后自然沉淀,取上清液3ml,加双抗;鼻咽抽取物标本,取无菌毛细吸管将洗液反复吹打,把粘液打散,而后按上述方法进行处理;器官组织标本,先用无菌的乳钵磨碎,用生理盐水配成20%悬液,2000r/min离心l0min,取上清液3ml按上述方法进行抗菌处理。
3 检验方法
3.1 材料与方法
3.1.1 器材孵卵箱(38℃、33～35℃:各一个)、照卵器、卵盘、注射器、消毒剂、镊子、无菌生理盐水、毛细吸管、试管、液体石蜡和封口胶等。
3.1.2方法当今国内外常用狗肾传代细胞(MDCK)。将已长成单层的细胞管弃生长液,用含有l00IU/ml双抗HanK's液洗2遍,用0.2～0.4ml处理过的标本液接种于细胞管,每份标本接种4管,置35T吸附1～2h后弃标本液,加入病毒培养液,其量为生长液的2倍。如标本液清亮和进行病毒传代时,可不必吸附,直接加入。置33～35℃孵育7d。从第3d开始观察细胞病变(CPE),如细胞出现颗粒增多、变圆、脱落达+++～++++时进行收获。如果7d还不出现CPE,可收集病毒培养液做血细胞凝集试验,在做试验前将细胞管冻融1～2次,以提高病毒滴度。阳性者可测定其血凝滴度并鉴定之,阴性者混合4管细胞液盲传2代,仍为阴性则弃去。
3.2 病毒鉴定新分离的病毒可用血细胞凝集抑制试验、补体结合试验和中和试验等方法进行鉴定。最常用和简单的方法是血细胞凝集抑制试验,必要时采用补体结合试验。
3.3 快速诊断流感病毒的主要感染部位是呼吸道上皮细胞,在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流感病毒抗原,通过直接检查脱落上皮细胞内抗原即可诊断。标本最好采用负压抽吸法收集呼吸道分泌物。
3.4 血清学诊断病毒分离是诊断流感最常用的方法之一,如因各方面因素未分离出病毒,血清学亦可作为一种代替手段,但必须收集急性期和恢复期双份血清,如恢复期血清特异性抗体较急性期增高4倍或以上,即可诊断。本章介绍两种常用的方法:血凝抑制试验和中和试验。
4 小 结
流行性感冒病毒(influenza virus)简称流感病毒。流感病毒属正粘病毒科,可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)3型。甲、乙、丙不仅反映了病毒被发现的前后顺序,更重要的是反映了对人危害程度的顺序,甲型常以流行的形式出现,可造成世界性的大流行,乙型常以局部流行的形式出现,丙型主要是侵犯婴幼儿。