RP-HPLC法测定复方金蒲片中延胡索乙素的含量

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作者：黄明立,黄东萍 ,蒋贵发,刘宗河

【摘要】 目的 建立复方金蒲片中延胡索乙素的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法,色谱柱为hypersil bds-c18,流动相为甲醇-5%乙酸(40∶60),并用浓氨试液调至ph 4.7,流速1.0 ml/min,柱温为25 ℃,检测波长280 nm。结果 延胡索乙素浓度在0.436～2.180 ?g范围内峰面积与浓度呈良好线性关系,r=0.999 7, 平均回收率为98.4%,延胡索乙素与其相邻杂质峰的分离度符合要求。结论 本方法简便、专属、重复性好,可用于延胡索乙素的定量分析。

【关键词】 复方金蒲片;延胡索乙素;高效液相色谱法;含量测定

abstract：objective to develop a method for determination of tetrahydropalmatine in compound jinpu tablets. methods rp-hplc method was used with hypersil bds-c18 column, the mobile phase was methanol-5% acetic acid (40∶60) adjusted ph to 4.7 by ammonia, flow rate was 1.0 ml/min, and column temperature was 25 ℃, with the detection wavelength at 280 nm. results the linear correlation was observed for the concentration of 0.436～2.180 ?g (r=0.999 7). the average recovery was 98.4%. resolution between tetrahydropalmatine and other peaks met the requirements. conclusion the method is convenient, selective and reproducible for quantitative analysis of tetrahydropalmatine.

key words：compound jinpu tablets;tetrahydropalmatine;rp-hplc;content determination

复方金蒲片是广西肿瘤研究所根据传统的中医药理论研制的民族药制剂,由金不换、蒲葵子、黄芪、螺旋藻等药物组成,具有活血祛瘀、行气止痛的功效,用于气滞血瘀证之肝癌等的治疗,配合放疗、化疗有增效作用。方中君药金不换为防己科植物华千金藤的块根,其主要成分为延胡索乙素。延胡索乙素的含量测定方法有紫外分光光度法[1]、薄层扫描法[2]和高效液相色谱法(hplc)[3]。因紫外分光光度法和薄层扫描法测定产生的误差较大,故本试验拟用hplc法测定复方金蒲片中延胡索乙素的含量,以更好地控制该制剂的质量。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪：岛津lc-10atvp泵,spd-10avp紫外检测器,威玛龙色谱工作站,bug25-12超声波清洗机(上海必能信超声波有限公司)。复方金蒲片(广西医科大学制药厂生产,批号20030901、20030902、20030903);延胡索乙素对照品(中国药品生物制品检定所)。甲醇为色谱纯;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为hypersil bds-c18(5 ?m,250 mm×4.6 mm);流动相为甲醇-5%乙酸(40∶60),并用浓氨试液调至ph 4.7;流速为1.0 ml/min;柱温25 ℃;检测波长为280 nm;进样量为10 ?l。理论塔板数为7 100,延胡索乙素与相邻杂质峰的分离度很好。色谱图见图1。

a b

注：a.对照品;b.供试品;1.延胡索乙素(9.62 min)

图1 复方金蒲片hplc图谱

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取延胡索乙素对照品10.9 mg,加甲醇溶解,并置50 ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度,作为对照品储备液。吸取对照品储备液25 ml置50 ml容量瓶中,制成每1 ml含0.109 mg的溶液,作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取复方金蒲片20片,去除糖衣,研细,精密称定,取1 g,精密称定,置50 ml离心管中,加甲醇10 ml,用超声波清洗机(25 khz,500 w)超声30 min,3 000 r/min离心10 min。倾出上清液,残渣加入甲醇10 ml,再超声30 min,过滤,滤液与前次上清液合并,置水浴蒸干。残渣加水10 ml使溶解,加稀盐酸调至ph 2,移至分液漏斗,加乙醚提取2次,每次10 ml。弃去乙醚层,水层加入氨试液调至ph 10,移至分液漏斗,加乙醚提取2次,每次10 ml。弃去水层,合并乙醚层,置水浴上蒸干,残渣加甲醇使溶解,并转移至5 ml容量瓶中,稀释至刻度,摇匀,滤过,作为供试品溶液。

2.3 线性关系考察

精密量取对照品储备液2、4、6、8、10 ml分别置10 ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。分别取10 ?l进样,测定峰面积,得回归方程：y=6.04×10-2+2.78×10-6x(n=5, r=0.999 7)。表明延胡索乙素浓度在0.436～2.180 ?g范围内,浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

取同一对照品溶液(每1 ml含0.109 mg延胡索乙素)进行日内和日间精密度试验,测定其峰面积,计算日内rsd=1.56% (n=6),日间rsd=1.77%(n=3)。

2.5 重复性试验

取同一批供试品,按含量测定方法重复测定,计算rsd=1.70%(n=5),表明本法重复性较好。

2.6 稳定性试验

另取供试品溶液,自配制后分别在0、2、4、8、12、24 h测定峰面积,rsd=1.61%,表明该溶液在24 h内稳定。

2.7 加样回收率试验

精密取同一批已知延胡索乙素含量的样品粉末约0.6 g,分别加入不同量的延胡索乙素对照品,按含量测定方法进行测定,结果见表1。表1 加样回收率试验结果(n=3)

2.8 样品含量测定

取供试品溶液,用微孔滤膜过滤,精密吸取10 ?l进样,按上述色谱条件测定,以外标峰面积法计算延胡索乙素的含量。3批样品的每片含量分别为2.56 mg(rsd=1.12%)、2.42 mg (rsd=0.97%)、2.18 mg(rsd=1.56%)。

3 讨论

本试验供试品溶液制备考察了回流提取和超声提取2种方法,均用甲醇作为提取溶剂,结果回流提取延胡索乙素的含量比超声法提取略低,所以选用了操作简单的超声法作为提取方法。在超声提取次数的考察中,我们发现,提取1、2、3次延胡索乙素的含量分别为每片1.86、2.18、2.19 mg,可见提取2次和提取3次没有太大的差别,故将提取次数确定为2次。

由于延胡索乙素为异喹啉类生物碱,易溶于酸,在碱性溶液中呈游离状,故采用“酸溶解碱沉淀”的方法进行精制,既提高了延胡索乙素的纯度,又大大减少了杂质对测定的影响。

本试验比较了甲醇-磷酸缓冲液、甲醇-乙酸(用氨水调节ph)2种色谱系统,结果后者的分离效果好。同时考察了ph分别为5.3、4.7、4.0的分离效果,发现流动相的ph为4.7时,延胡索乙素的峰形最好,分离度也最高。

【参考文献】

[1] 王 捷,刘宗河,焦爱军,等.紫外分光光度法测定复方金蒲片中延胡索乙素含量[j].广西医学,2004,26(12)：1770-1771.

[2] 李永庆,陈 蕾,朱霁虹,等.薄层扫描法测定痛立克注射液中延胡索乙素、粉防己碱和防己诺林碱的含量[j].药物分析杂志,2001,21(1)：28-30.

[3] 朱央央,余伯阳.rp-hplc测定元胡止痛方中延胡索乙素和欧前胡素的含量[j].中成药,2004,26(6)：455-458.