维生素E对小鼠日本血吸虫病肝纤维化的治疗作用及其机制

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作者：牛丽文，杨镇，肖亮，张爱龙，李岽健，乌剑利

【关键词】 ,血吸虫病,日本；肝硬化；维生素E；氧化性应激；肝星状细胞；胶原I型

【Abstract】 AIM: To investigate the therapeutic effect of vitamin E(Vit E) and its mechanisms on liver fibrosis induced by Schistosoma japonicum infection in mice. METHODS: Mice were infected with Schistosoma japonicum cercariae percutaneously, and were divided into 5 groups: normal control group, model group, and intervention groups which were treated with three different doses of Vit E, 150, 50, and 5 mg/kg. That live fibrosis reached gradeⅡ or above was considered to be a marker of therapeutic start. The mice were killed at the end of the 8th week. Liver lesions were evaluated using HE and VG staining. Immunohistochemistry for αsmooth muscle actin (αSMA) as an activated hepatic stellate cell(HSC) marker was performed to detect and quantify activated HSC by SP technique. The malondialdehyde (MDA) content and superoxide dismutase (SOD) activity in liver tissue were determined by spectrophotometric method. The α1(I) procollagen mRNA expression was measured by RTPCR. RESULTS: Vit E reduced MDA content ［(5.00±0.31) μmol/g vs (11.66±1.84) μmol/g, P<0.05］ and increased SOD activity［(249.84±26.22) μkat/g vs (120.11±42.61) μkat/g, P<0.05］ in the liver in model group in a dosedependent manner. Besides, Vit E decreased the number of αSMA positive cells ［(0.41±0.02) vs (0.68±0.02), P<0.05］ in a dosedependent manner. Further, Vit E diminished the increased collagen content ［(0.23±0.01) vs (0.60±0.11), P<0.05］ and inhibited the increased α1 (I) procollagen mRNA expression ［(0.28±0.01) vs (0.85±0.15), P<0.05］ in the liver in model group. CONCLUSION: Vit E has evident therapeutic effects on liver fibrosis resulted from Schistosoma japonicum infection in mice, and the mechanisms are associated with antilipid peroxidation, inhibition of HSC activation and proliferation, and reduction of α1(I) procollagen mRNA expression and collagen production by Vit E.

【Keywords】 Schistosomiasis japonica; liver cirrhosis; vitamin E; oxidative stress; hepatic stellate cell(HSC); collagen type I

【摘要】 目的： 探讨维生素E (Vit E)抗小鼠日本血吸虫病肝纤维化作用及其机制. 方法： 用日本血吸虫尾蚴皮肤敷贴法感染小鼠，构建日本血吸虫病肝纤维化模型，以肝纤维化达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始Vit E治疗标志. 实验分5组： 正常对照组、模型组及Vit E高、中、低剂量组(每日150, 50, 5 mg/kg), 8 wk末处死动物，HE和VG染色对肝组织进行病理学检查，分光光度法检测肝组织丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，免疫组化SP法检测肝星状细胞(HSC)标记物α平滑肌动蛋白(αSMA)表达，RTPCR方法检测肝脏α1(I)型前胶原mRNA表达. 结果： Vit E降低模型组肝脏MDA含量［(5.00±0.31) μmol/g vs (11.66±1.84) μmol/g, P<0.05］，提高SOD活性［(249.84±26.22) μkat/g vs (120.11±42.61) μkat/g, P<0.05］；减少αSMA阳性表达 ［(0.41±0.02) vs (0.68±0.02), P<0.05］；降低肝脏胶原含量［(0.23±0.01) vs (0.60±0.11), P<0.05］和α1(I)型前胶原基因表达［(0.28±0.01) vs (0.85±0.15), P<0.05］. 结论： Vit E具有抗小鼠日本血吸虫病肝纤维化作用，其机制与抗脂质过氧化作用、抑制HSC活化和增殖、降低α1(I)型前胶原基因表达和胶原合成有关.

【关键词】 血吸虫病，日本；肝硬化；维生素E；氧化性应激；肝星状细胞；胶原I型

日本血吸虫病是我国危害最大的寄生虫病之一，而肝纤维化是日本血吸虫病致死和形成严重并发症最重要的原因. 研究表明，在血吸虫病肝纤维化形成过程中，氧化应激发挥重要作用，参与血吸虫对宿主的损伤，自由基可能是血吸虫病主要的致病因素［1］. Vit E作为机体防御氧化应激损伤的重要抗氧化剂，已应用于治疗肝纤维化，但有关Vit E抗日本血吸虫病肝纤维化作用的研究国内外报道甚少，而Vit E治疗血吸虫病肝纤维化的作用机制尚未见文献报道. 我们观察Vit E抗日本血吸虫病肝纤维化作用，探讨其机制如下.

1材料和方法

1.1材料健康雄性昆明小鼠(18～22) g及日本血吸虫尾蚴阳性钉螺(湖北省血吸虫病防治研究所)，皮肤敷贴法感染日本血吸虫尾蚴（20±1）条/只，于感染后8, 10, 12 wk末分别处死6只小鼠后取肝组织进行病理学检查，以肝纤维化达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为Vit E开始治疗的标志，即在12 wk末开始给予Vit E治疗. 32只感染小鼠分为4组，每组8只： 1组，模型组；2组，Vit E高剂量组(Vit E每日150 mg/kg)；3组，中剂量组(50 mg/kg)；4组，低剂量组(5 mg/kg). Vit E胶丸由厦门鱼肝油厂生产，剪破胶丸，用蒸馏水配制所需浓度的混悬液，灌胃给药每日1次，连续8 wk. 另取同一批健康小鼠10只作为正常对照组. 丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，免疫组化所用试剂(北京博奥申生物技术有限公司)，TRIzol(美国Invitrogen)，逆转录试剂盒(美国Promega)，Taq酶(Gibco公司). α1(I)型前胶原引物序列参照Gen Bank，上游序列: 5′ GAG CGG AGA GTA CTG GAT CG 3′，下游序列: 5′ TGC TGT AGG TGA AGC GAC TG 3′，扩增片段为419 bp；内参照βactin引物上游序列: 5′ TGT CAC CAA CTG GGA CGA TA 3′，下游序列: 5′ AGG TCT TTA CGG ATG TCA ACG 3′，扩增片段为654 bp，引物由北京奥科生物技术有限公司合成.

1.2方法断颈处死小鼠，取肝右叶相同部位肝组织2块，1块于-70℃保存，测定肝组织匀浆MDA含量、SOD活性及肝脏α1(I)型前胶原基因表达；1块固定于100 mL/L中性甲醛，石蜡包埋，行HE和VG及αSMA免疫组化染色.

1.2.1肝组织病理学及纤维化评分常规行HE和VG染色，光镜下观察肝小叶病理变化及肝纤维化程度分级： 0级20=1，正常；Ⅰ级21=2，胶原纤维包绕虫卵肉芽肿周围；Ⅱ级22=4，汇管区有大量纤维，小叶间仅有少量纤维；Ⅲ级23=8，纤维组织大量延伸至肝小叶间. 应用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统，每组每次测量20～30个由单个成熟虫卵形成的肉芽肿两个直角相交直径，以(最大横径+最大纵径)/2为平均值，并计算各组均值；测定VG染色切片胶原纤维灰度面积(S)和视野总面积(T)，用S/T比值表示胶原含量.

1.2.2肝组织匀浆MDA含量和SOD活性测定硫代巴比妥酸比色法测定肝脏MDA含量，黄嘌呤氧化法测定SOD活性，按试剂盒说明书要求操作.

1.2.3肝脏αSMA免疫组化采用SP法，兔抗鼠αSMA抗体稀释度1∶100，用已知阳性片做阳性对照，PBS液代替一抗做阴性对照，细胞内出现棕黄色颗粒为阳性细胞. 应用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统对αSMA免疫组化切片进行平均吸光度值检测.

1.2.4肝脏α1(I)型前胶原基因表达应用TRIzol试剂盒，参照说明提取肝组织总RNA，逆转录合成cDNA，采用20 μL反应体系. PCR反应条件： 95℃变性5 min, 94℃ 30 s, 94℃ 30 s, 52.7℃退火30 s, 72℃延伸30 s，循环30次，最后72℃终止10 min，以βactin为内参照. PCR产物分析： PCR产物经2 kg/L琼脂糖凝胶2 μL电泳检测，结果照相并存入凝胶分析系统，以βactin光密度值标化α1(I)型前型胶原基因光密度值，得到α1(I)型前胶原基因相对含量.

统计学处理： 采用SPSS 12.0统计软件对结果进行统计学分析，数据均采用x±s表示，采用方差分析进行比较，P<0.05为差异有统计学意义. 多组均数间的多重比较采用LSD法.

2结果

2.1肝脏病理学变化对照组无明显组织学异常. 1组： HE和VG染色示小鼠血吸虫病肝纤维化模型建立成功. 血吸虫感染后8 wk，虫卵肉芽肿大小和数量达到高峰，大量炎性细胞浸润；随感染时间延长，肉芽肿逐渐缩小，肝细胞变性、坏死和炎性细胞浸润明显减轻，胶原纤维逐渐增多. 至20 wk，胶原纤维由最初的细线状变为条索状或网状分布在汇管区、虫卵肉芽肿周围并延伸至肝小叶间(图1A，B). Vit E组肉芽肿大小与1组比较无显著差异(P>0.05)，对肝细胞变性、坏死和炎性细胞浸润程度影响不明显；2，3组虽有不同程度肝纤维化，但纤维带变细、窄、短，胶原纤维局限于汇管区和肉芽肿内及周围，肝小叶间很少有胶原沉积(图1C)，与1组比较，肝纤维化程度分级差异有显著性(P<0.05). 4组与1组比较无明显差异(表1).

2.2肝脏MDA含量和SOD活性与对照组比较，1组SOD活性下降(P<0.05)，MDA含量增多(P<0.05)，有统计学意义. 2, 3组SOD活性与1组比较升高(P<0.05)，但与对照组比较仍相差甚远(P<0.05)；2, 3组MDA含量与1组比较减少(P<0.05)，2组与对照组比较无显著性差异(P>0.05)；4组与1组比较无明显差异(表1).

A: 模型组×100; B: 模型组×200; C: Vit E组×100.

图1肝脏胶原纤维分布VG

2.3肝脏αSMA表达对照组肝脏血管壁、胆管壁平滑肌有少许αSMA阳性表达，汇管区及肝窦内基本无αSMA阳性表达；1组汇管区、虫卵肉芽肿内及周围胶原纤维沉积处可见大量索状αSMA阳性表达细胞，肝窦内可见多量αSMA阳性表达细胞(图2A, B)；2, 3组αSMA阳性细胞数目减少(P<0.05)，局限在汇管区、纤细的纤维隔及肉芽肿内及周围，肝窦内表达减少(图2C)；4组与1组比较无明显差异(表1).

A: 模型组×100; B: 模型组×200; C: Vit E组×100.表1Vit E对虫卵肉芽肿直径、MAD含量、SOD活性、αSMA平均吸光度值及肝纤维程度的影响

2.4肝脏α1(I)型前胶原基因表达和胶原含量1组(即感染20 wk末)α1(I)型前胶原mRNA和胶原含量高于感染12 wk时(P<0.05和P<0.05)和对照组(P<0.05和P<0.05). 2, 3组α1(I)型前胶原mRNA和胶原含量与1组比较差异有显著性(P<0.05和P<0.05)；2组α1(I)型前胶原mRNA和胶原含量与感染12 wk时比较有显著性差异(P<0.05和P<0.05)，而3组无统计学意义(P>0.05)；4组与1组比较无明显差异(图3，表2).

M: marker; 1: 模型组; 2: 感染12 wk; 3: Vit E高剂量组; 4: Vit E中剂量组; 5: Vit E低剂量组.

图3RTPCR分析各组α1(I)型前胶原mRNA表达表2Vit E对胶原含量和α1(I)型前胶原基因表达的影响

3讨论

氧化应激是多种病因所致肝纤维化发生发展的重要环节之一［2］. Vit E作为体内一个重要的抗氧化剂，有抗肝纤维化［3-5］、抗肿瘤、抗衰老等功能. 宗道明等［5］研究表明，Vit E可降低血吸虫病肝纤维化患者血清肝纤维化各项指标，对肝纤维化组织形态学的好转有积极作用，治疗血吸虫病肝纤维化疗效显著. 但目前有关Vit E抗血吸虫病肝纤维化机制少见文献报道.

Chojkier等［6］研究表明，Vit E抑制HSC α1(I)型胶原基因表达. 我们发现，Vit E降低肝脏α1(I)型前胶原基因表达、胶原含量及肝纤维化程度分级；2组α1(I)型前胶原mRNA和胶原含量显著低于感染12wk时. 可见Vit E可延缓血吸虫病肝纤维化进程，减轻肝纤维化程度. 本研究中，1组MDA含量增加，SOD活性下降，说明日本血吸虫病肝纤维化之肝脏发生氧化应激反应，产生脂质过氧化损伤，与文献［1］报道一致，而Vit E能够不同程度地逆转这些改变，对此具有一定的治疗作用；并且Vit E抑制HSC活化和增殖. Vit E可能通过抑制肝脏脂质过氧化作用和由此产生的活性醛，如MDA 和4羟化壬烯(4HNE)，从而抑制MDA和4HNE蛋白加合物形成，该加合物是实验性肝损伤和肝纤维化联系的枢纽［7］，进而抑制氧化应激诱导的HSC α1(I)型前型胶原基因表达和蛋白合成［8］. 我们发现Vit E尚不能完全逆转SOD活性，故对其剂量、疗程以及与其它药物的联合应用有待于进一步的研究.

总之，Vit E可延缓血吸虫病肝纤维化进程，减轻肝纤维化程度，其机制与抗脂质过氧化作用、抑制HSC活化和增殖、降低α1(I)型前胶原基因表达和胶原合成有关，适当补充Vit E进行抗纤维化治疗是一种可行的手段，有望成为一种廉价、不良反应少、疗效显著的临床用药.

【参考文献】

［1］ ElSokkary GH, Omar HM, Hassanein AFMM, et al. Melatonin reduces oxidative damage and increases survival of mice infected with Schistosoma mansoni［J］. Free Radic Biol Med, 2002,32(4):319-332.

［2］ Parola M, Robino G. Oxidative stressrelated molecules and liver fibrosis［J］. J Heptol, 2001,35(2):297-306.

［3］ Houglum K, Venkataramani A, Lyche K, et al. A pilot study of the effects of dalphatocopherol on hepatic stellate cell activation in chronic hepatitis C［J］. Gastroenterology, 1997,113(4):1069-1073.

［4］ 孙军，丁虹，沈志祥. 维生素E对小鼠慢性乙醇性肝损害的保护作用［J］. 胃肠病学和肝病学杂志，2001,10(1):47-49.

［5］ 宗道明，冯韵琴，赵晓贡. 维生素E治疗血吸虫病肝纤维化的临床研究［J］. 中国寄生虫防治杂志,2005,18(3):212-213.

［6］ Chojkier M, Houglum K, Lee KS, et al. Long and shortterm Dαtocopherol supplementation inhibits liver collagen α1(Ⅰ) gene expression［J］. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 1998,275(6):G1480G1485.

［7］ Bedossa P, Houglum K, Trautwein C, et al. Stimulation of collagen α1(Ⅰ) gene expression is associated with lipid peroxidation in hepatocellular injury: A link to tissue fibrosis? ［J］. Hepatology, 1994,19(5):1262-1271.

［8］ Casini A, Ceni E, Salzano R, et al. Neutrophilderived superoxide anion induces lipid peroxidation and stimulate collagen synthesis in human hepatic Stellate cells: Role of nitric oxide［J］. Hepatology, 1997,25(2):361-367