免疫技术对农药检测的可行性

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20世纪90年代以来免疫分析法逐渐成为在检测农药残留优先研究、开发和应用的一项分析技术。美国化学学会将免疫分析方法与GC、HPLC一起列为化学农药残留分析的三大支柱技术，世界粮农组织也积极推荐此项技术，免疫分析技术成为21世纪最具竞争力和挑战性的超微量检测技术［14］。

1免疫吸附分析法

现在研究最多的为酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫吸附法(IGCA)，两者的共同特点是使用方便、操作简单，能够批量生产且成本较低，能够满足现场快速检测的需要。ELISA常用的酶包括辣根过氧化物酶、磷酸酶、β－D－半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、青霉素酶、乙酰胆碱酶、苹果酸脱氢酶、荧光素酶丙酮、酸激酶等。这些酶都具有易于提取、保存、催化率高、专一性强、活性基团多的优点，同时检测酶活的方法简单快速，在与抗体或抗原结合后酶活会表现出抑制或增强的特点。而IGCA使用胶体金显色，不需要加入酶，标记物更加稳定，应用范围更广，但灵敏度一般不如ELISA好。部分有机磷农药的免疫吸附分析见表1。在应用免疫吸附分析法对有机磷农药进行检测技术的开发中，抗体抗原的选择、样品基质和反应体系中有机溶剂的使用、离子强度和pH都对免疫吸附分析法有较大的影响。在使用通用抗体进行有机磷农药多残留检测分析中，通用半抗原结构上一个元素或者一个基团的变化，都可能引起免疫吸附分析法检测结果的不同。1998年Jeffre等［29］通过一组相似结构的半抗原的免疫反应得到的抗体进行ELISA对比试验，得出同类半抗原的不同链长、P上连接的O或S都会影响得到的抗体的性质，从而影响对不同农药的特异性吸附。Manchis等［30］利用两种类似结构的半抗原产生的抗体来对毒死蜱进行检测，得到不同的标准曲线，juan等［19］在对毒死蜱进行ELISA检测实验中也得到相同的结论。Josep等［31］用ELISA对甲基谷硫磷和亚胺硫磷进行检测中，也得出不同结构的半抗原产生的抗体对检测结果影响较大。McAdam等［32］利用多克隆抗体对杀螟松进行ELISA检测，得出IC50为23ng/mL，最低检出限为2ng/mL，而Cho等［33］利用单克隆抗体对其进行ELISA，同样基质中得出IC50为3．7ng/mL，最低检出限为0．5ng/mL。2006年Watanabe等［34］利用计算机模拟得出的结果IC50为0．23ng/mL，线性范围0．087～2ng/mL，最低检出限为0．033ng/mL。McAdem和Hill［32］用杀螟松单克隆抗体进行ELISA检测得到的线性范围是100～2000ng/mL，Skerrit等［35］发现杀螟松的单克隆的抗体还会与甲基毒死蜱和甲基嘧啶磷反应。样品的基质对免疫吸附法的稳定性也有一定影响。在杀螟磷的检测中，样品为苹果时，平均回收率为112%，变异系数10%，样品为桃子时，平均回收率为111%，变异系数12%［34］。2011年梁赤周等［36］分别在梨、香蕉、坚果、大米、菠菜、胡萝卜中用ELISA对三唑磷进行检测，得到的加标回收率和变异系数都有差异。亚胺硫磷在苹果、橙汁和苹果汁的ELISA检测中，加标回收率和变异系数也各不相同［37］。Ercegovich等［38］检测血浆中的对硫磷残留检出限为280pg/mL，在缓冲液中灵敏度能增加10倍。而有些农药的检测中，基质效应可以忽略，如Lvanov等［39］对谷硫磷检测中蜂蜜的基质效应可忽略不计。反应体系中使用的有机溶剂、离子强度和pH都对免疫吸附分析法也会有较大的影响。Xu等［40］在对河流、湖泊及地下水样品中对硫磷的检测后发现，使用固相萃取工艺前后，剂量－反应曲线变化较大。在有机溶剂的使用中，甲醇容易造成负面的影响［25，41］。此外，反应体系的pH及离子浓度都会对检测结果造成影响［16，20，21，24，25］。交叉反应率在免疫吸附分析法中主要受抗体类型的影响，使用单克隆抗体进行ELISA，除结构特别类似的化合物外，交叉反应率较低。Watanabe等［34］报道，在检测杀螟松的交叉反应中，只有3种农药交叉反应率较高，结果如表2。2011年Young等［42］使用毒死蜱单克隆抗体的IGCA对毒死蜱检测进行交叉反应试验，仅甲基毒死蜱IC50为190ng/mL，交叉反应率为13%，其余8种类似农药均无交叉反应，特异性良好。Manchis等［30］利用ELISA对毒死蜱进行交叉反应实验，甲基毒死蜱交叉反应率也仅为18．3%，其余六种农药均小于4%。sullivan等［43］对毒死蜱检测试验也得到相似的结果。在亚胺硫磷的检测中，单克隆的抗体建立的ELISA方法在交叉反应实验中也表现较好［37］。

2其他免疫分析法

化学发光免疫分析法，电化学发光免疫分析法，荧光免疫分析法及放射免疫分析法也是较为常见的免疫分析方法。自1977年Halman等［22］创立了化学发光免疫分析方法(CLIA)以来，在临床医学、环境和食品安全检测中进展很快。化学发光分析是用能够产生化学发光的物质来标记抗体或抗原，在与待测的抗原或抗体免疫吸附后，分离发光标记物或直接加入发光启动剂而进行抗原或抗体的定量或定性分析。最常用的发光标记物为鲁米诺及其衍生物、吖啶酯衍生物、过氧化物酶和碱性磷酸酶。其中辣根过氧化物酶与碱性磷酸酶在临床检验中应用最广泛［44］。Jin等［45］在2010年建立了果蔬中有机磷农药三唑磷的CLIA法，线性范围为0．04～5ng/mL，最低检出限为0．063ng/mL，生菜、胡萝卜、苹果、水和土壤的加标回收率在67．52%～122．0%之间。与液－质法进行对比，显示出良好的准确性。电化学免疫分析法(ECLIA)通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号，使体系中的组分反应产生化学发光对物质进行定量定性的分析。相比CLIA，是用电极代替发光启动剂，能更精确的控制反应的开始。Wei等［46］利用ECLIA对甲基毒死蜱进行检测，得到线性范围在0．4～20ng/mL，在土壤和葡萄中的加标回收率96．4%～109．3%，变异系数为9．1%。Cons等在1941年用荧光素和抗体的结合来定位组织中的抗原，提出了荧光免疫分析法(FIA)的概念［47］。荧光素是该方法的关键，在特定波长的激发光照射下，有机荧光分子被激发并发出荧光，这些荧光分子能在短时间内多次重复被激发用以检测。荧光免疫分析法就是根据荧光分子的这种特性进行定量分析的。FIA对甲基对硫磷检测的加标回收率在85%～100%之间，交叉反应试验与检测耗时表现比ECLIA好［48］。荧光偏振免疫测定法(FPIA)甲基对硫磷检测的加标回收率85%～110%之间，最低检出限为15ng/mL，线性范围为25～10000ng/mL，且变异系数为1．5%～9．1%，交叉反应表现良好［49］。Xu等［50］在时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)对有机磷农药多残留检测中，检出限低于10ng/mL，变异系数在3．5%～14．5%之间，加标回收率71．3%～126．8%［51］。水样的加标回收率从74．8%～121．3%不等，变异系数在6．4%～15．1%之间。放射免疫分析方法(RIA)是利用同位素标记的和未标记的抗原混合物与抗体发生竞争性免疫反应，通过检测游离同位素标记抗原达到对抗原定量定性分析。1960年美国化学家R．S．耶洛和S．A．贝尔森提出此法后，被广泛用于生物学和临床诊断分析中，为此耶洛于1977年获诺贝尔生理学医学奖。80年代初，应用此法测定的生物活性物质已达300种以上。1981年Ercegovich等［38］首先建立了RIA对硫磷的检测，在人的血液和莴苣叶片上的检出限为10～20ng/mL，水中的检出限可达4ng/mL。

3展望

食品和环境中农药残留超标，不仅严重威胁着生态环境问题，也影响着人民的身体健康，与此同时，利用检测技术手段来不断提高农产品贸易的绿色壁垒。目前农药残留免疫分析技术尚处于研究开发阶段，只有少数产品化，且多数为单一品种农药的检测。随着分子生物技术、基金重组技术、噬菌体展示技术的飞速发展，建立灵敏度更高、重现性更好的检测方法，同时免疫分析技术也会朝着农药多残留检测的方向发展。因此，免疫分析技术会以其自身的绝对优势不断进行完善，将在有机磷农药快速检测方面发挥越来越重要的作用。

作者：梁彦 单位：吉林农业科技学院