高效苯酚降解菌的研究进展

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摘 要：本文主要从苯酚的生物降解机理，高效苯酚降解菌的分离、筛选、鉴定、分类、菌种改良及降酚菌的降解特性等方面阐述了苯酚降解菌降解含酚废水的研究进展，并将降酚菌株的传统培养技术与新培养技术进行比较，总结培养技术的优点与不足；对生物法降解苯酚处理含酚废水的应用前景进行了展望。

关键词：降酚菌培育；菌株筛选；降解机理；菌种改良；降解特性

中图分类号：X592 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20160732001

简介

苯酚及其衍生物属于芳香族化合物，是一种原生质毒物，与多数生物活性体接触可产生毒性[1]。随着现代工农业的快速发展，化工、焦化、炼油、合成纤维、医药等工厂排出的废水、废气、废渣中大多含有高浓度的酚类有机污染物，若处理不当不仅会导致生态环境的污染，也会对人体产生危害。当人体摄入过量的酚类物质时，体内蛋白质会变性，产生急性中毒症状，使人体中枢神经系统受损，导致死亡。鉴于苯酚对环境和人类造成的危害，各国相继将苯酚列入优先控制污染物的名单中。为有效降解含酚废水，国内外学者对废水中苯酚及其衍生物的降解进行了深入研究。目前处理含酚废水的主要技术有：物理-化学法、生物法、化学法、物理法。物理法和化学法适用于高浓度的含酚废水，但有设备投资高，能耗大，容易产生二次污染等缺陷[2]，且物理处理技术和化学处理技术对废水的处理工艺要求较为严格；而生物降解法具有耗能较少、效率高、成本低、无二次污染等特点，将在污水治理上得到更广泛的应用[3]。

1 降酚菌的降解机理

降酚菌对酚类物质的降解主要分为好氧降解和厌氧降解2种，多数情况下采用前者，且降酚菌好氧代谢途径较为复杂，如图1所示。降酚菌在好氧代谢过程中，苯酚及其衍生物在苯酚羟化酶的作用下被催化成相应的邻苯二酚，之后邻苯二酚在2种不同的途径和酶系统的作用下开环形成碳氢化合物[4]。由邻苯二酚2，3-双加氧酶的催化作用下间位开环转化为2-羟基粘糠半醛，经逐步转化后形成4-羟基-α-酮基戊酸，最终生成乙酸和丙酮酸等产物后进入三羧酸循环，进行糖代谢途径，最终被降酚菌分解；由邻苯二酚1、2-双加氧酶的催化作用下邻位开环转化为粘糠酸，沿β-酮基己二酸的途径降解，最终生成乙酰辅酶A、琥珀酸等产物进入微生物的三羧酸循环，继续被降酚菌利用[5]。此2种途径是微生物好氧降解苯酚的关键步骤，且在不同的降酚菌中这类双加氧酶具有高度的同源性。

研究表明，降酚菌在厌氧代谢过程中也能降解苯酚。如，Lack等[6]研究发现苯酚在厌氧代谢中是苯酚直接被羧化为4-羧基苯甲酸，使其转化为苯甲酰辅酶A，然后形成乙酸等小分子化合物，从而达到降解的目的，该途径被称作是Kolbe-Schmitt羧化反应。

2 降酚菌的培育和改良

酚类物质虽然是一种中强度的原生质毒物，但很多微生物为适应环境中的酚类物质，将酚类物质作为其生长、发育的碳源之一[7-8]。因此，被酚类物质污染的土壤和水源中含有较多的此类降酚特性的菌株，为获得纯种的降酚菌株进行研究和生产，需要将降酚特性菌株从酚类污染地分离，再进行具有针对性的培养、改良和育种，最后人为地投入污染地区进行微生物修复。

2.1 降酚菌的培养

降酚菌的传统培养方法主要是采用富集培养技术，此技术分为初代培养和次代培养2个阶段。将采集的标本置于富集培养基上进行初代培养，之后分离获得单一菌落；单一菌落投加到以苯酚为唯一碳源的培养基中进行次代培养，以逐量分批的方法提高培养基中苯酚的浓度，从而筛选出耐高浓度苯酚的高效降酚菌株。例如：郑贝贝[9]等利用富集培养技术从某焦化厂的焦化废水中筛选出的C3菌株为红球菌属（Rhodococcus sp.）细菌，该菌株可在28h内将浓度为600mg/L的苯酚完全降解，对浓度高达1000mg/L的苯酚同样具有高效的降解能力。

由于培养条件和培养基成分不同等原因，该方法具有一定的局限性。为了克服此局限性，高通量筛选技术、基因拼接技术等新的培养方法逐渐被运用到菌株的筛选和培养中。基因拼接技术又称为基因工程，该技术可通过对生物的基因进行重新组合和改造，产生符合人类需求的基因产物[10]。而高通量筛选技术则是以分子水平和细胞水平为基础，通过一次实验获得大量的信息，进而筛选出有价值的信息。同传统方法相比，新技术在分离培养菌株时不但灵敏快速、科学准确，而且较大限度的节省了实验材料，减小了培育菌株的操作误差，简化了实验流程。

2.2 降酚菌的鉴定方法

降酚菌株传统的鉴定方法主要是根据对菌种形态的观察、生理生化等表型特征来对菌种进行鉴定，其主要包括菌株形状、颜色、革兰氏染色结果，以及葡萄糖产酸实验、兼性厌氧实验、V.P实验、淀粉水解试验、甲基红实验等。根据菌株的鉴定结果，参考《常见细菌系统鉴定手册》[11]或《伯杰氏手册》进行比较和判断，从而实现对菌株的初步鉴定。但常规的鉴定方法具有步骤繁琐，耗时较长，准确性较低等缺点。张孝龙等[12]利用苯酚培养基对降酚菌分离和筛选，根据电子显微镜观察到的菌体形态、菌株生理生化特征和16SrRNA基因鉴定，对菌株进行初步生物学鉴定。经鉴定筛选出的菌株中Phe-03为壤霉菌属（Agromyces），Phe-05为棒杆菌属（Corynebacterium）。

近些年来，随着生物技术的精细化与现代分子生物学理论和技术的普及化，BIOLOG法、操作分类单元聚类分析、16SrDNA鉴定、全细胞脂肪酸分析鉴定系统和PLFA法等新的鉴定手段逐渐运用到降酚菌的菌种鉴定中。与传统方法相比，新的鉴定方法具有灵敏度高，分辨力强、速度快、无需分离培养纯种微生物、测定便捷等优点，一定程度的提高了鉴定效率。

2.3 降酚菌的改良

传统改良降酚菌的方法包括以紫外线、微波、激光等射线作为诱变介质的物理诱变和以烷化剂、抗生素等化学药物作为诱变介质的化学诱变。菌株经过诱变介质诱变后，降酚能力有较大幅度的提高。例如：冯思琦[13]等，从土壤中筛选出一株可降解高浓度苯酚的酵母菌菌株。对该菌株直接采用紫外诱变技术进行驯化和培育，结果表明：未经诱变的菌株在48h内对苯酚浓度为500mg/L的溶液降解率为96.3%，而经过紫外诱变后，36h内可将500mg/L苯酚完全降解。

针对降解酚类有机污染物，可将苯酚作为底物培养降酚菌，使培养基中的苯酚浓度以逐量分批的方法进行提高，以此方法驯化的菌株降酚能力会有明显的提升。例如：关海滨[14]等将扩大培养的菌株首先接入苯酚浓度为0.5g/L的培养基中培养，重复上述培养步骤，使培养基中的苯酚浓度逐步达到2.2g/L，成功得到一株具有较高降酚能力的菌株GDYW-0027。实验表明，该菌株在48h内对初始浓度为2.2g/L苯酚的降解率为86.73%。

虽然驯化可以提高降酚菌的降解能力，但由于苯酚浓度不断的提高，菌株降解苯酚的速率却逐渐降低。例如：菌株GDYW-0027[15]对0.1g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L和2.2g/L质量浓度的苯酚溶液48h内的降解率分别为100%、96.98%、95.68%、92.61%和86.73%，苯酚降解率明显降低。

2.4 降酚菌的降解特性

利用降酚菌株处理高浓度含酚废水时，混合菌株降解苯酚的能力要明显大于单一菌株的降解能力，并且在苯酚浓度较高时仍具有较高的降解率。例如：李鲜珠[16]等从焦化厂污泥中分离出4株高效降酚菌。通过单一菌株和组合菌株对苯酚降解率的试验表明，在16h内4株混合菌株的苯酚降解率均高于单一菌株，混合菌株在降解苯酚时具有协同作用。沈锡辉[17]等分离到一株既可降解苯酚，又可降解萘及其它多种芳烃的红球菌PNAN5菌株（Rhodococcussp. Strain PNAN5），该菌株能以苯酚、对甲酚、萘和苯甲酸为唯一碳源生长，具有降解单环和双环芳烃的能力。该实验表明，以苯酚为唯一碳源培育出的降酚菌除了可以降解苯酚外，还可降解其它酚类物质及其衍生物。

3 生物法处理污水现状

目前，随着国内化工行业一体化进程不断加快，工业园区污水处理设施逐渐完善，一些大型化工园区污水处理设备和技术已达到国际水平。淄博市的建陶企业采用投加菌株的方法处理建陶企业的含酚废水[21]，针对企业废水的复杂程度，投加了28种不同的菌株，实验表明，6h内酚的去除率为89.1%，实现了回用水标准及国家城镇污水处理厂一级排放标准。Peyton等[22]以苯酚为模型化合物，利用耐盐微生物对高盐度的工业废水进行处理，并进行高盐（10%）对苯酚的生物降解动力学的探讨。实验表明，对苯酚的生物降解动力学为苯酚浓度（0-50mg/L）的零级动力学。

与传统的物化处理技术相比，新技术在废水的处理工艺上因其鲜明的特点而逐渐被应用于某些企业的废水处理中。在处理过程中由于针对性较强、效率高等优势，亦是将来废水治理的发展趋势。

4 问题及展望

含酚废水毒性高、来源广，严重威胁着人类的健康安全，是环境保护中不可忽视的问题。因此，筛选出对酚类物质具有高降解能力的微生物，对于含酚废水的生物修复具有深远的意义。从被污染环境中获得高效降酚菌后，研究其降解特性后，应用到含酚废水处理系统中，是现今处理含酚废水较为经济有效的途径之一。但大多数降酚菌株能够降解的酚浓度较低。而且，废水是一个十分复杂的混合体系，用单一菌种处理含酚废水，很难达到国家排放标准。因此，对于高浓度的含酚废水在生物学方面的研究，有待进一步的探索。

随着科学技术的快速发展，现代化技术手段逐渐被运用到高效菌株的培育中，如利用细胞融合技术处理菌株、生化技术培养菌株等。而且，利用细胞融合和基因重组等技术选育高效降解菌也已成为发展的趋势。高效菌株的研究和应用技术已得到蓬勃发展，可以预想，降酚菌株用于处理工业废水必将在实际应用中发挥出巨大的作用。

参考文献

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