鸭源新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及与不同分离株的反应性

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摘要：为了制备鸭源新城疫病毒基因Ⅶ型毒株hn蛋白的单克隆抗体，将构建的原核表达载体pET28（a）-HN转化BL21（DE3）进行原核表达，纯化HN重组蛋白，并免疫6周龄BALB/c小鼠，分离脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合，克隆培养并筛选杂交瘤细胞株，制备单克隆抗体，并对其生物学特性进行了鉴定。结果显示，表达纯化的重组HN蛋白分子质量约为49 ku，用ELISA方法成功筛选出4株针对新城疫Ⅶ型毒株HN蛋白的单克隆抗体，其中2H7抗体抗原谱较广，具有中和活性，为进一步研究HN蛋白功能和临床诊断奠定了基础。

关键词：新城疫病毒；单克隆抗体；HN蛋白

中D分类号：S852.65+7 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）01-0121-05

Abstract The recombinant plasmid pET28（a）-HN was transformed into BL21（DE3） to purify the recombinant HN protein. The 6-week-old BALB/c mice were immunized by the protein. The spleen lymphocytes were separated and conducted the cell fusion with SP2/0 cells at 3 days after the last immunization. The hybridoma cell lines were obtained by clone culture and indirect ELISA assay. Then the monoclonal antibodies against HN protein of newcastle disease virus （NDV） were preparated. Their biologic properties were identified. The results showed that the molecular mass of purified recombinant HN protein was about 49 ku. Four monoclonal antibodies were screened. In which， the antibody 2H7 had broad antigen spectrum and neutralization activity. This study provided a basis for further research on the HN protein function and clinical diagnosis.

Keywords Newcastle disease virus； Monoclonal antibody； HN protein

新城疫（Newcastle disease， ND）是由新城疫病毒引起的多种禽类的一种急性、高度接触性传染病，是危害世界养禽业的重要传染病之一，给各国养禽业造成了严重的经济损失。新城疫病毒属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）副粘病毒亚科（Paramyxovirus）腮腺炎病毒属（Rubulavirus）成员，其宿主范围广泛，迄今已知能自然或人工感染的鸟类超过250种。自1926年从印度尼西亚爪哇首次分离到NDV以来，世界上已发生了4次ND大流行。虽然NDV只有一个血清型，但是每次ND流行都会有新的基因型出现，且具有一定地域性[1]。NDV分子流行病学研究表明：自20世纪90年代中期以来，我国流行的NDV病毒，在鸽上主要为Ⅵb亚型[2]，其他家禽90%以上为基因Ⅶ型。基因Ⅶ型病毒与我国使用最广泛的基因Ⅱ型疫苗病毒（LaSota）之间存在明显的遗传差异和抗原差异[3]。本研究以原核表达纯化的鸭NDV强毒株SD03 的HN蛋白为免疫原，研制了4株能分泌抗NDV HN蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并鉴定其与实验室不同基因型分离株的反应性，为新城疫快速诊断方法的建立奠定一定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞与实验动物

鸭源基因Ⅶ型新城疫强毒Duck/China/SD03/2009（SD03），由本实验室分离并保存[4]，GenBank登录号JN400895；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和鸡胚成纤维细胞DF1，由本实验室保存，均以含10%胎牛血清的DMEM培养基培养；BALB/c小鼠，购自山东大学实验动物中心。

1.2 载体和试剂

pET28（a）-HN重组质粒，由本实验室构建并保存，其中HN基因克隆自鸭源新城疫强毒SD03；Qiagen Ni-NTA Agarose和SBA单克隆抗体分型试剂盒，购自济南赛恩斯生物技术公司；荧光素（FITC）标记的山羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG，均购自SantaCruz公司；ECL发光试剂盒、预染蛋白质、Marker，均购自Clontech公司；显影、定影试剂盒，均购自山东赛恩斯公司。

1.3 SD03强毒株HN重组蛋白的表达

将构建好的pET28（a）-HN载体转化BL21（DE3）感受态细胞于含卡那霉素的固体培养基上培养，鉴定阳性菌，挑阳性单菌落接种于含Kan （终浓度为50 μg/mL）的500 mL LB液体培养基中，37℃振荡（200 r/min），培养至OD600为0.6，加入IPTG至终浓度为 0.6 mmol/L，37℃继续培养6 h，收集菌液，12 000× g、4℃、20 min离心后收集菌体，以20 mL PBS重悬，超声波破碎后离心，收集沉淀，然后按照Qiagen Ni-NTA Agrose试剂盒说明书的实验步骤对获得的包涵体进行纯化。SDS-PAGE分析蛋白纯化结果，用考马斯亮蓝法（Bradford）法测定纯化蛋白浓度，分装，-80℃保存备用。

1.4 单克隆抗体的制备

1.4.1 免疫BALB/c小鼠 以上述提纯的HN融合蛋白免疫6周龄BALB/c雌性小鼠，每次每只免疫剂量50 μg，免疫方法为腹腔注射，共免疫4次。每次免疫的间隔期为2周，首免用弗氏完全佐剂按体积比1∶1乳化蛋白，二免至四免用弗氏不完全佐剂按体积比1∶1乳化蛋白。三免一周后，小鼠眼眶采血，测血清抗体效价。四免两周后，选择效价最高的小鼠，以不加佐剂的蛋白腹腔注射加强免疫一次，3 d后取小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0细胞融合。

1.4.2 细胞融合 取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤胞按常规方法进行细胞融合，于5% CO2细胞培养箱中37℃培养，当SP2/0细胞和脾细胞全部死亡时，用新鲜配制的HT培养基全部置换HAT培养基。逐日观察，待融合的杂交瘤细胞生长至孔底十分之一，取上清检测。

1.4.3 阳性杂交瘤细胞的筛选与建株 阳性杂交瘤细胞的筛选采用ELISA方法进行，具体参照文献[5]，阳性细胞株扩大培养并进行有限稀释法克隆3～5次，筛选出能稳定分泌特异性单抗的杂交瘤，并制备单抗腹水，测定其ELISA效价。

1.5 单克隆抗体生物学特性的鉴定

1.5.1 ELISA 效价测定 包被酶标板，加入单抗腹水，并进行倍比稀释，间接ELISA方法检测。

1.5.2 特异性测定 以SPF鸡胚尿囊液、禽流感病毒、禽传染性支气管炎病毒等包被96 孔酶标板，间接ELISA 鉴定各株单抗反应特异性。

1.5.3 细胞中和活性测定 采用细胞中和试验鉴定单抗中和活性，具体参见文献[6]。

1.5.4 间接免疫荧光测定 将200 TCID50的SD03毒株接种CEF细胞单层，37℃作用2 h，更换含1%胎牛血清的DMEM，3 d后做IFA检测，具体步骤参照文献[7]。

1.5.5 Western-blot检测 取1 mL诱导表达的菌液，12 000 r/min离心2 min，弃上清，加100 μL灭菌双蒸水，悬浮沉淀，加100 μL 上样缓冲液，煮沸5～10 min。取20 μL/孔加样，进行SDS-PAGE电泳和电转印。转印的膜经5%脱脂乳封闭后，加入1∶5 000稀释的单抗腹水，37℃轻摇作用1 h，洗涤后加入1∶4 000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，室温轻摇作用1 h，于暗室中加入ECL发光液作用1 min，再转至暗盒中曝光5 min后进行显影与定影[7]。

1.5.6 单抗亚型的鉴定 用单克隆抗体分型试剂盒对4株杂交瘤细胞培养上清进行亚型鉴定，具体步骤参见试剂盒说明书，加入终止液终止反应后在450 nm处测定OD值。

1.6 单抗排谱试验

挑选的24株NDV分离株，测定血凝抑制价，配制相应的4单位病毒后与筛选出的有HI活性的单克隆抗体分别进行HI 试验，以AIV、IBV、IBDV和EDSV作为阴性对照[8]。

2 结果与分析

2.1 HN蛋白的纯化结果

表达的HN蛋白经镍柱亲和纯化后SDS-PAGE电泳检测，获得较纯的目的重组蛋白。经Western blotting分析，结果显示在49 ku附近有1条清晰的蛋白印迹（图1）。

2.2 杂交瘤细胞系的建立

以表达纯化的SD03的HN蛋白为免疫原， 经3次融合， 间接ELISA 筛选， 共筛选出4株能稳定分泌特异性抗NDV单抗的杂交瘤细胞，并分别命名为杂交瘤细胞2H7、2G6、1E1、2E11。

2.3 单抗特性鉴定结果

2.3.1 ELISA效价 单抗2H7的ELISA效价为6.4×105，2G6、1E1的ELISA效价均为3.2×105，2E11的ELISA效价为8×104（表1）。

2.3.2 特异性 4株单抗与SPF鸡胚尿囊液、禽流感病毒等均不反应，具有良好的特异性。

2.3.3 单抗中和性 单抗2H7具有中和性，与SD03的中和效价为128，其余3株单抗无细胞中和性（中和效价

2.3.4 单克隆抗体的间接免疫荧光检测结果 将接种SD03毒株的CEF细胞进行间接免疫荧光检测，结果显示，以2H7的单抗腹水为一抗，可在细胞中检测到特异性黄绿色荧光，而未接种NDV的细胞中检测不到特异性的荧光（图2）。

2.3.5 单克隆抗体的Western-blot检测结果 Western-blot结果显示单抗2H7、2G6、2E11、1E1均能识别亲本病毒SD03株表达的HN蛋白，并出现特异性条带（图3），条带大小与预期相符（49 ku）。

2.3.6 单抗亚型的鉴定结果 单抗亚型鉴定发现，2H7与其他3株单抗均属于IgG1，κ链。

2.4 单抗排谱试验结果

通过与SD03的HI试验发现，单抗1E1、2G6、2E11无血凝抑制性，2H7血凝抑制价为27（表1）。挑选24株NDV分离株，测定血凝抑制价，配制相应的4单位病毒后与2H7进行HI 试验，结果显示2H7与F48E8及基因Ⅵ型和Ⅶ型的所有毒株都反应，而与基因Ⅰ型和基因Ⅱ及ClassⅠ的2型和3型所有测试毒株都不反应（表2）。

3 讨论与结论

NDV被世界动物卫生组织（OIE）列为法定报告疫病，对养禽业的危害极其严重。近年来，鸭、鹅等水禽感染NDV并发病的病例越来越多，给中国的水禽养殖业带来了较大的损失[9]。由于NDV的毒力不断演变，因此快速准确诊断成为控制该病的重要手段。