电针“足三里”对大鼠脊髓背角内ERK1/2磷酸化水平的影响
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[摘 要] 目的：探讨针刺镇痛机理。方法：将动物随机分为5组；正常对照组、单纯电针组、福尔马林组、福尔马，林加同侧电针组和福尔马林加对侧电针组。造模方式为大鼠右足后垫皮下注射4％福尔马林溶液100μL。电针刺激“足三里”穴，疏密波，频率2～15 Hz，强度2～3 mA，持续30 min。1．5 h后麻醉处死动物，制片观察。结果：正常对照组脊髓后角浅层仅见个别腰段脊髓磷酸化ERK1／2(pERK1／2)阳性细胞(6．45±1．05)个；单纯电针组在电针同侧的脊髓背角有少量阳性细胞出现(14．07±3．19)个；福尔马林模型组的同侧脊髓背侧角浅层有大量阳性细胞被激活(26．57±4．93)个，主要分布于Ⅰ和Ⅱ0。层；模型加同侧电针治疗组阳性细胞数(20．79±5．21)个与福尔马林模型组比较有减少的趋势，但统计学差异无显著意义；模型加对侧电针治疗组的炎症侧脊髓背角的阳性细胞数(14．75±3．03)个较福尔马林模型组显著减少(P＜0．05)。结论：电针抑制脊髓后角ERK1／2信号分子的磷酸化，可能与其镇痛效应的发生机制有关。
[主题词] 针刺镇痛原理；电针；穴，足三里；脊髓／针灸效应；磷酸化酶磷酸酶／代谢十分明确。近年研究发现，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路的激活在炎性痛敏以及神经性疼痛的产生和维持过程中发挥了关键作用[1,2]。MAPK属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族，是胞外信号从细胞表面传导至细胞核内部的重要传递者，通过对转录因子磷酸化调节参与细胞反应基因的转录表达，或直接作用于胞浆底物。目前已至少发现MAPK的4个亚族：细胞外信号调节激酶(ERK1／2)、P38MAPK、C―JunN―末端激酶／应激―活化蛋白激酶(JNK／SAPK)和ERK5。其中，ERK1／2通过胞膜去极化和钙内流活化，由上游丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)激活，参与细胞的增殖分化和神经元的可塑性，例如长程增强效应、学习记忆和一系列应激后脑内神经元和胶质细胞反应[3]。最近一些研究报道ERK1／2磷酸化水平变化发生于伤害性疼痛通路，在不同的外周疼痛模型中均发现脊髓背角磷酸化ERK表达增加，而用其上游MEK的阻滞剂能减轻大鼠的痛觉过敏表现[4]。本研究旨在观察电针“足三里”对大鼠足底炎性痛刺激诱发的脊髓背角内磷酸化erk1／2表达的影响，从细胞信号转导的角度探索针刺镇痛的机制。
1 材料与方法
1．1 动物分组
成年SD大鼠25只，雄性，体重0．25～0．3kg，由第四军医大学动物中心提供，许可证号：SCXK(军2002―005)。随机分为5组：福尔马林组，单纯电针组，福尔马林加同侧电针治疗组、福尔马林加对侧电针治疗组及正常对照组，每组各5只。
1．2 干预措施
对注射福尔马林制作急性炎性痛模型的动物，用40 g／L戊巴比妥钠(10 mg／kg)腹腔麻醉后，于大鼠右足后垫皮下注射4％福尔马林溶液100μL，造成右足底的炎性病灶。
电针刺激选穴和刺激方法：因在针刺镇痛中，选择与疼痛部位为同一或邻近脊髓节段的穴位可取得较好的镇痛效应[5]，且已有实验证实电针“足三里”可起到镇痛的效应[6]。故选取与足底炎性病灶邻近的“足三里”穴针刺。大鼠取穴参照《常用动物针灸穴位图谱》。电针使用参数参照相关文献[7]。大鼠“足三里”位于膝关节后外侧腓骨小头下约5 mm处。模型加电针治疗的两组在福尔马林造模后5 min进行针刺，其中模型加同侧电针治疗组于右侧“足三里”进针；模型加对侧电针治疗组于左侧“足三里”进针。单纯电针组动物未造模，麻醉后于右侧“足三里”针刺。用直径0．35 mm毫针直刺入穴位约7 mm深。WQ―10D1电针治疗仪的一根电极接于毫针末端，另一电极夹在电针同侧的大鼠耳郭上。采用疏密波刺激，频率2～15 Hz，强度2～3 mA，以大鼠电针侧肢体轻微抖动为度。针刺时间为30 min。
正常对照组，动物未造模，麻醉后右侧“足三里”进针，但不通电，30 min后去针。福尔马林组，仅造右足底炎性病灶，未予针刺。
1．3 取材和切片
福尔马林组造模后1．5 h经心脏灌流处死，其余各组于针刺后1 h经心脏灌流处死。先用100 mL生理盐水快速灌流以冲洗血液，然后用预冷的4％多聚甲醛400 mL灌注，先快灌200 mL，然后慢灌200 mL，共约1h。灌注完毕后取脊髓腰膨大段，在相同固定液中固定2h后，放人20％蔗糖溶液，4℃过夜。组织沉底后，用冰冻切片机连续切片，隔5张取1张，片厚50 pm。收集于冻存液中于-20℃保存待用。
1．4 免疫组织化学染色
从-20℃冰箱取出切片，0．01 mol／L PBS漂洗5 min×3次后，浸入800mL／L甲醇和3 mL／L。双氧水封闭30min，0．01 mol／LPBS漂洗5 min×3次；ABC方法如下：兔抗大鼠ERK抗体(1：1000，CellSigna－ling Inc)孵育切片，室温下过夜，约12 h。经0．01 mol／LPBS漂洗5 minX 3次后，生物素化的羊抗兔IgG(1：500，Vector)孵育切片，室温下4h，0．01 mol／LPBS漂洗5 minx3次；生物素―卵白素―辣根过氧化物酶复合物(ABC，1：500，Vector)孵育切片，室温下2 h，0．01 mol／L PBS漂洗5 minX 3次；DAB蓝色反应呈色。当阳性产物呈深蓝色而背底几乎无色时终止反应，经脱水、透明和封片后，镜检。
1．5 主要观察指标和统计分析
主要观察指标为处理侧脊髓背角阳性细胞数。每只动物取经免疫组化染色的腰膨大段脊髓横断平面10个，在10×20光镜下观察并分别统计右侧脊髓背角阳性细胞数，其平均数即为该动物该侧脊髓背角阳性细胞数，每组5个动物取平均值即为该组动物该侧脊髓背侧角阳性细胞数，采用随机设计方差分析(one-wayANOVA)进行统计分析。
2 结果
腰膨大段右侧脊髓背角的pERK1／2免疫组织化学染色见图1～图5。如图所示，正常对照组脊髓后角浅层仅见个别pERK1／2阳性细胞，呈双侧分布，见图1(A、F)。单纯电针组在电针同侧的脊髓背角有少量阳性细胞出现，见图2(B、G)。而在福尔马林模型组，同侧脊髓背侧角浅层有大量阳性细胞被激活，主要分布于背角中内1／4的工和Ⅱ。层，染色的阳性细胞突起长、数量多，见图3(C、H)；模型加同侧电针治疗组的阳性细胞数与福尔马林模型
组比较有下降的趋势，但差异不显著，染色的细胞突起较少，见图4(D、I)；在模型加对侧电针治疗组，炎症侧脊髓背角的阳性细胞数较福尔马林模型组显著减少，见图5(E、J)。图1F～图5J分别为图1A～图5E的部分放大。各组间脊髓背侧角磷酸化ERK1／2阳性细胞数的比较见表1
3 讨论
电针对疼痛有明显的调制作用，这已被众多的行为学实验所证实。电针能显著抑制福尔马林导致的大鼠缩腿、舔爪等自发痛行为反应[8，9]。脊髓背角是痛觉信息传人的中继站，是疼痛刺激调节的关键部位。电针在脊髓水平的调制作用主要体现在影响脊髓内分子水平的变化，包括影响多种参与痛觉调制的递质、受体、细胞因子和基因表达。例如：研究发现电针能引起大鼠脊髓中内吗啡肽和强啡肽的释放，两者协同镇痛[10]；另外，电针引起的大鼠脊髓释放的SP也发挥镇痛作用[11]；还有实验观察到脊髓单胺类递质参与炎性痛大鼠电针镇痛的调制过程[12]。在受体方面，大鼠脊髓5―羟色胺IA受体和IC／2受体亚型参与高频电针镇痛”3)。电针也通过下调突触前的N―甲基―D―天门冬氨酸(NM―DA)受体NR1亚型蛋白来调制痛敏的形成[14]。参与痛觉调制的分子众多，从疼痛和针刺的信号转导角度进行研究可理清这些分子的作用途径和关系并进一步阐明电针镇痛的机制。近年来有研究证实MAPK在胞浆信号转导中起重要作用，与伤害性神经元的可塑性变化相关[3]。背角伤害性神经元可塑性变化是痛觉超敏化的主要原因之一。MAPK能被多种炎性刺激所激活，并对炎症的发生、发展起重要作用[15]。最近研究发现MAPK家族成员ERK1／2的磷酸化发生于伤害性疼痛通路中，急性伤害性刺激可诱发ERK在脊髓后角神经元的磷酸化[16]。磷酸化ERK1／2(pERK1／2)通过直接或间接(通过中间激酶)磷酸化一些关键结构如受体、离子通道、激酶而调节膜兴奋性和突触可塑性变化。ERK还可以调节原癌基因(c―fos)等以外的长时程突触可塑性变化的基因[3]。提示ERK不仅产生短期非转录依赖的功能性变化，也产生基因转录增加引起的长期的适应性变化。
在炎性痛中，炎性介质如前列腺素E2、5―羟色胺、肾上腺素和神经生长因子(NGF)在初级传人神经元通过蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)的活化产生痛觉过敏[17]。最近研究还发现肾上腺素诱导的痛觉过敏也伴有ERK级联的激活，但其Ras-MEK-ERK途径激活不依赖PKA或PKC[1]。ERK调节转录的途径首先是ERK易位于核内调节转录因子环磷腺苷(cAMP)效应元件结合蛋白(CREB)，通过CREB激酶即白体S6激酶2(RSK2)，激活cAMP效应元件(CRE)，从而调节下游基因的表达。Ji等[18]发现CRE的作用位点在神经激肽―1(NK―1)基因和强啡肽原的启动子区。ERK的激活导致前强啡肽原(prodynophin)tuRNA和P物质受体神经激肽―1表达增加，从而增加佐剂性关节炎大鼠对热伤害性刺激和机械性伤害刺激的痛敏。伤害性刺激引起CREB活化并通过CRE介导转录引起脊髓背角内许多基因转录激活：c―fos、强啡肽、神经肽Y(NPY)、促生长激素神经肽、酪氨酸激酶受体B(TrkB)等，从而促成疼痛超敏的持久性疼痛产生[19]。王瑞辉等E20]研究证明电针对佐剂性关节炎大鼠脊髓原癌基因c―fos表达有影响，其变化与ERK1／2磷酸化水平变化是一致的，也正说明ERK活化后通过调节基因的转录激活调制痛觉。以上资料说明，ERK1／2通路在痛觉的产生和维持中有重要作用。
脊髓背角是初级感觉神经元的传人部位，既能直接调制痛觉，又能接受上位中枢的下行抑制信号，是整合处理痛信号的初级中枢，成为研究感觉通路的焦点之一。本实验证实了足底炎症性病灶可引起ERK在脊髓背角的激活，电针病灶对侧“足三里”ERK磷酸化的表达减少，表明ERK的磷酸化在炎性痛和针刺镇痛中起重要作用。电针通过调节脊髓内ERK磷酸化而达到镇痛效果，笔者推测其途径可能通过抑制炎性痛引起的ERK磷酸化，而减少脑源性神经营养因子(BDNF)等致痛物质的产生，同时阻断ERK活化后对下游转录因子的激活。至于电针病灶同侧足三里ERK变化不显著，可能是因为痛信号和针刺信号有相似的上传通路，均在脊髓整合，在短时期内同侧电针无法抑制福尔马林刺激引起的ERK磷酸化所致。
总之，针刺镇痛是多途径、多靶点的。最新研究证明MAPK家族的另一个成员P38 MAPK蛋白激酶也与辣根素受体(VRl)以及NGF共同参与炎症痛敏形成，在炎性痛的信号转导中起重要作用[21]。实验以完全福氏佐剂(CFA)佐剂性关节炎大鼠电针治疗后，痛阈上升，背根神经节内P38 MAPK磷酸化水平下降[22]。且发现JNK／SAPK和P38、ERK一样，其磷酸化也在吗啡诱导降钙素基因相关肽和P物质在初级感觉传入的增加过程中起作用。可见，MAPK通路在电针痛觉调制中起重要作用，而针刺镇痛涉及的信号分子不止一个，有关针刺镇痛的信号转导机制尚需进一步研究。
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(收稿日期：2005－11-25，齐淑兰发稿)