高效液相色谱法测定环吡酮胺乳膏中药物的含量及其体外透皮释放量的研究

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【摘要】目的探讨环吡酮胺乳膏应用高效液相色谱法进行药物含量与体外透皮释放量测定的效果。方法检测波长305 nm；流动相：乙腈-0.1%乙二胺四醋酸二钠溶液(70:30)；Kromasil C18色谱柱；应用单室Franz扩散池、大鼠腹皮进行透皮释放实验, 对比市面乳膏与自制乳膏的透皮结果。结果环吡酮胺范围介于20~180 μg/mL间, 平均回收率99.8%, RSD为0.70%, 线性关系较好(r=0.9997), 相关因素为0.9673, 市面乳膏与自制乳膏透皮结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论采用高效液相色谱法测定环吡酮胺乳膏不会受皮肤成分与软膏基质影响, 且操作简便, 准确率高, 测定效果理想。

【关键词】环吡酮胺；高效液相色谱法；体外透皮释放；药物；测定

Research on high performance liquid chromatography method for the determination of drugs in ciclopirox olamine cream and its in vitro transdermal release quantityFANG Rao-ying, ZHONG Shi-shun, YE Xiu-jin, et al. Guangdong Institute of Biological Products and Drugs, Guangzhou 510440, China

【Abstract】Objective To determinate content of drugs in ciclopirox olamine cream by high performance liquid chromatography method(HPLC) and its in vitro transdermal release. Methods Detection wavelength of 305 nm; mobile phase: acetonitrile -0.1% four acetic acid disodium ethylenediamine solution(70-30); Kromasil C18 chromatographic column; application of single chamber Franz diffusion pool, big abdomen skin transdermal release experiments, contrasted the transdermal cream with homemade cream market results. Results Ciclopirox olamine cream range between 20~180 μg/ml, the average recovery was 99.8%, RSD was 0.70%, had good linear relationship (r=0.9997), and related factors 0.9673, cream market and the results of the homemade cream transdermal no statistical significance(P>0.05). Conclusion By high performance liquid chromatography determination of ciclopirox olamine cream won’t be affected by the composition of the skin with cream base with easy operation, high accuracy, ideal measurement effect.

【Key words】Ciclopirox olamine cream; High performance liquid chromatography; In vitro transdermal release; Drugs; Determination

环吡酮胺乳膏(ciclopirox olamine ointment)作为一种广谱抗真菌药物, 其通过阻断真菌细胞对钾离子、蛋白质前体物质及其他物质的摄取, 从而导致真菌因缺乏营养来源而死亡, 具有极高渗透性, 可对霉菌、皮肤癣菌、酵母菌及其他真菌产生较强的抗菌活性作用［1］。高效液相色谱法作为色谱法的主要分支之一, 以其高效、高灵敏度、高压、范围广与分析速度快等特点成为近年来化学、医学、工业、农学等学科领域的重要分离分析试验技术［2］。本文应用高效液相色谱法对环吡酮胺乳膏药物含量及体外透皮释放量进行测定, 成功使样品分离, 结果较为理想。现报告如下。

1仪器与试药

1. 1仪器本次测定选取高效液相色谱仪(SPECTRA SYSTEM P1000, 美国热电集团TSP公司)；紫外检测器(SPECTRA SYSTEM UV1000, 美国热电集团TSP公司)；TK-12A型透皮扩散试验仪(扩散面积3 cm2, 磁力搅拌速度300 r/min, 接收池体积7 ml3)。

1. 2试药环吡酮胺乳膏{批号:052001, 052002, 052003, 湖北科益药业股份有限公司, 国药准字H10890061, Loproxcream［联邦德国药厂(HoechestAG E.R.G)］, 10 g/支}；环吡酮胺对照品(批号:100232-200201, 中国药品生物制品检定所)。

2方法及结果

2. 1药物含量测定

2. 1. 1配制溶液供试品溶液：精密称取批号052001, 052002, 052003环吡酮胺乳膏各10 g置入烧杯, 添加甲醇25 ml, 应用温水浴加热溶解, 再置于冷水浴内冷却, 滤过, 而后以同法行3次提取, 滤液合并后置入100 ml容量瓶内, 以甲醇定容, 盖塞, 翻转摇匀, 取得供试品溶液。

2. 1. 2线性关系定容精密称取对照品25 mg置入50 ml量瓶中, 加甲醇溶解、摇匀后, 加甲醇定容至刻度；分别精吸1、3、5、7、9 ml置入25 ml量瓶中, 再次定容摇匀, 用注射器从5个量瓶中分别精密吸取20 μl注入液相色谱仪, 记录色谱图, 以峰面积对浓度行线性回归, 回归方程为A=-55657+9522C, r=0.9997。结果显示, 环吡酮胺线系关系较好, 范围介于20~180 μg/ml之间。

2. 1. 3色谱条件Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×200 mm, 5 μm)；流速1.0 ml/min；进样量20 μl；流动相：乙腈-0.1%乙二胺四醋酸二钠溶液(70:30)；柱温35℃；检测波长305 nm。理论塔板数以环吡酮胺计>2000, 其余成分无干扰。

2. 1. 4稳定性、重复性及精密度实验取对照品溶液持续进样5次, 结果显示环吡酮胺峰面积RSD为0.41%。根据“2.1.1”步骤配制供试品溶液, 按时间顺序依次于0、1、3、5、7、9、11 h进样, 结果显示环吡酮胺峰面积RSD为1.05%(n=7), 证实在11 h内, 供试品溶液即可达到稳定状态。另取9份同批样品分别配制成供试品溶液, 经进样测定, 环吡酮胺含量RSD为0.40%, 表明该测定方式具有较好重复性。

2. 1. 5统计学方法用SPSS18.0统计学软件处理数据, 计数资料实施χ2检验, P

2. 1. 6回收率试验分别为9份0.5 g环吡酮胺乳膏添加适量对照品, 配制成高、中、低3种浓度的供试品溶液各3份, 再分别进行进样测定, 结果显示环吡酮胺平均回收率99.8%, RSD为0.70%。

2. 1. 7样品含量测定取3批样品, 批号分别为052001, 052002, 052003, 均配制成供试器溶液, 分别对供试器溶液与对环吡酮胺对照品溶液进行进样测定, 3批样品均根据外标法以峰面积计算其中环吡酮胺平均含量, 并结合2005年出版的《中华人民共和国药典》［3］中关于环吡酮胺乳膏含量测定方法进行测定, 最终得出3批样品环吡酮胺平均含量。详情见表1。

表1高效液相色谱法与紫外吸收法样品结果对比(%)

方法 052001 052001 052001

紫外吸收法 94.93 94.68 96.19

高效液相色谱法 95.03 94.42 95.67

注：P>0.05, 差异无统计学意义

2. 2体外透皮释放量研究

2. 2. 1实验方式首先将大鼠皮肤固定于扩散装置的接受室与扩散室间, 将0.9%氯化钠溶液注入接受室内, 令液面刚好碰触皮肤内层, 而后将气泡排除, 启动搅拌器, 取2 g乳膏均匀涂抹于皮肤表皮, 而后每过1 h取样7 ml, 再同时补充7 ml 0.9%氯化钠溶液, 至8 h止, 利用0.8 μm微孔滤膜进行过滤, 从中取续滤液实行进样测定, 药物累积渗透量应用零级方程对时间数据拟合, 获得直线斜率即透皮速率J。

2. 2. 2实验结果市面乳膏：回归曲线Q=41.03t-77.51, R=0.9652；透皮速率41.03 J, 8 h累积渗透量290.91 μg。自制乳膏：回归曲线Q=42.95 T-77.83, R=0.9673；透皮速率42.95 J, 8 h累积渗透量306.42 μg。组间差异无统计学意义(P>0.05)。

3讨论

《中华人民共和国药典》中紫外分光光度法虽操作简便, 但结果易受时间、温度及浓度等因素的影响［4］, 而如表1所见, 本次测定中, 应用紫外吸收法与高效液相色谱法分别测定3批样品, 结果差异无统计学意义(P>0.05), 证明高效液相色谱法不但可测定出环吡酮胺乳膏含量及相关物质, 还可作为鉴别药物稳定性的可靠依据。另外, 经方法学考察, 显示经皮渗透释放液中杂质在以乙腈-0.1%乙二胺四醋酸二钠溶液(70:30)为流动相的色谱条件下最不易对环吡酮胺色谱峰产生干扰, 可实现杂质色谱峰与主成分色谱峰的彻底分离, 且具有灵敏性高、专属性强、操作方便快捷等特点, 适于测定环吡酮胺乳膏含量及其体外透皮释放量。

实验测量中, 累积渗透量(Q)对t1/2行线性回归, 8份测定样品R均为0.96以上, 表明累积渗透量(Q)与t1/2间存在较佳相关性, 环吡酮胺累积渗透量可随时间推移而上升。结果显示, 8份样品的透皮速率、8 h累积渗透量及相关系数均呈平行, 证实该结果真实可信, 其不足之处是以大鼠腹皮作实验, 与人体皮肤相比存在一定差距, 有待更深入研究。

参考文献

［1］ 陈晶, 王京辉, 傅欣彤, 等. 高效液相色谱法测定银杏叶提取物中4个酚酸类化合物的含量.药物分析杂志, 2013, 33(05): 818-821.

［2］ 民. 环吡酮胺阴道栓微生物限度检查方法学验证.海峡药学, 2012, 24(08):82-84.

［3］ 宋妍, 李莹, 金立弟. HPLC法测定环吡酮胺搽剂的含量及其有关物质.中国药师, 2013, 16(05):684-686.

［4］ 姚洪艳. HPLC法测定环吡酮胺乳膏的有关物质.黑龙江科技信息, 2012(34):36.

［收稿日期：2014-04-15］