赤芍乙醇提取物和水提取物抗病毒研究
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[摘要] 目的 研究赤芍乙醇提取物和水提取物的抗病毒活性。 方法 Y合细胞病变效应法（CPE）及CCK-8试剂盒，以治疗指数（TI）为指标，研究赤芍乙醇和水提取物对呼吸道合胞病毒（RSV）、单纯疱疹病毒（HSV-1）、柯萨奇病毒（COX-B5）、手足口病毒（EV71）的预防、直接杀灭和穿入后抑制作用。 结果 赤芍乙醇和水提取物对RSV、HSV-1、COX-B5、EV71没有预防和穿入后的阻断作用，对EV71没有直接杀灭作用，对RSV、HSV-1、COX-B5有直接杀灭作用，水提取物对RSV和COX-B5直接杀灭作用效果较好，TI值分别为15.034和13.076；75%乙醇提取物对HSV-1的直接杀灭作用较好，TI值为10.944；阳性对照药对四种病毒均有作用，其中利巴韦林对RSV直接杀灭、预防和穿入后阻断作用的TI值分别为19.760、16.760、18.028，对COX-B5的TI值分别为17.482、15.516、16.568，对EV71的TI值分别43.158、24.296、22.162；阿昔洛韦对HSV-1直接杀灭、预防和穿入后阻断作用的TI值分别为23.432、10.922、23.417。 结论 赤芍乙醇和水提取物对RSV、HSV-1、COX-B5具有直接杀灭作用，对EV71无直接杀灭作用，对四种病毒无预防和穿入后阻断作用，阳性对照药对四种病毒具有直接杀灭、预防和穿入后阻断作用。
[关键词] 赤芍；抗病毒；呼吸道合胞病毒；单纯疱疹病毒；柯萨奇病毒
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（a）-0004-04
Study on the antiviral activity of ethanol extract and water extract of Paeoniae Radix Rubra
LIU Xiangwen HOU Lin ZHANG Chenghua SUN Chunyong LIU Jin′an TIAN Jingzhen
College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Shandong Province， Ji'nan 250355， China
[Abstract] Objective To investigate the antiviral activity of ethanol extract and water extract of Paeoniae Radix Rubra. Methods Combining with cytopathic effect （CPE） method and CCK-8， taking therapeutic index （TI） as index， the prevention， direct killing and penetration inhibition effects of ethanol extract and water extract of Paeoniae Radix Rubra for respiratory syncytial virus （RSV）， herpes simplex virus （HSV-1）， Coxsackie virus （COX-B5）， hand， foot and mouth virus （EV71） were researched. Results The ethanol extract and water extract of Paeoniae Radix Rubra had no prevention and penetration inhibition effects for RSV， HSV-1， COX-B5， EV71， which had no direct killing effects for EV71 and had direct killing effects for RSV， HSV-1， COX-B5， among which， the water extract had better direct killing effects for RSV and COX-B5， the TI value was 15.034 and 13.076 respectively. 75% ethanol extract of Paeoniae Radix Rubra had good direct killing effect for HSV-1， the TI value was 10.944， all positive control drugs had effects for the four kinds of virus， among which， the TI values of Ribavirin for the direct killing， prevention and penetration inhibition effects of RSV were 19.760， 16.760， 18.028 respectively， which were 17.482， 15.516， 16.568 for COX-B5， 43.158， 24.296， 22.162 for EV71. The TI values of Acyclovir for the direct killing， prevention and penetration inhibition effects of HSV-1 were 23.432， 10.922， 23.417 respectively. Conclusion The ethanol extract and water extract of Paeoniae Radix Rubra has direct killing effects for RSV， HSV-1， COX-B5， has no direct killing effects for EV71， has no prevention and penetration inhibition effects for four kinds of virus， while the positive control drugs have direct killing， prevention and penetration inhibition effects for the four kinds of virus.
[Key words] Paeoniae Radix Rubra； Antiviral； Respiratory syncytial virus； Herpes simplex virus； Coxsackie virus
赤芍（Paeoniae Radix Rubra）为毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）或川赤芍（Paeonia veitchii Lynch）的干燥根，具有清热凉血、散瘀止痛的功效[1]。现代研究表明，赤芍主要含有挥发油[2]、苷类[3]、黄酮[4]等多种化学成分，具有抗肿瘤[5]、抑制肺纤维化[6]、抗血栓[7]、抗内毒素[8]、抗肝纤维化[9]、神经保护[10]、心脏保护[11]、抗氧化[12]、抗抑郁[13]、抗惊厥[14]等药理作用，但其在抗病毒领域的研究较少，本研究将赤芍分别进行75%乙醇提取后和水提取，研究其对呼吸道合胞病毒（RSV）、单纯疱疹病毒（HSV）、柯萨奇病毒（COX-B5）、手足口病毒（EV71）的体外抗病毒活性，为我国丰富的赤芍资源开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
赤芍药材（购买于济南建联中药店，经山东中医药大学徐凌川教授鉴定为毛茛科植物芍药的干燥根）；利巴韦林注射液（山东鲁抗辰欣药业有限公司，批号：1410206811）；阿昔洛韦注射液（亚宝药业制药有限公司，批号：15062005）；人喉癌胞（Hep-2，为RSV、HSV-1、COX-B5宿主细胞）、人横纹肌肉瘤细胞（RD，为EV71宿主细胞）、RSV、HSV-1、COX-B5、EV71由山东省医学科学院基础医学研究所提供，本研究室保存。
1.2 试剂
细胞培养液（美国HyClone公司，批号AAJ207653），二甲基亚砜（即DMSO，Amresco公司，批号2705C127）；胰酶（美国Gibco公司，批号1737903）；Cell Counting Kit-8（上海碧云天生物技术有限公司，编号C0039）；乙醇等化学试剂均为分析纯。
1.3 供试品的制备
取干燥的赤芍粉末（过60目筛）20 g，10倍量水提取2 h，取滤液抽虑、浓缩，减压干燥，取适量干燥产物用2%DMSO溶液配成16 mg/mL的供试品溶液，即为赤芍水提取物供试品；75%乙醇回流提取物的制备方法同“赤芍水提取物供试品”制备方法。利巴韦林和阿昔洛韦用2%的DMSO溶液配成50 mg/mL的溶液作为阳性对照药供试品。
1.4 病毒的扩增
将病毒株200 μL接种于单层细胞上，加入5 mL细胞培养液，置37℃、5%CO2病毒培养箱中培养，设细胞对照，当细胞出现90%以上的病变时，反复冻融3次，吹打，1000 r/min离心5 min，取上清液分装备用。
1.5 病毒毒力的测定
将消化好Hep-2和RD细胞，以105个/mL细胞浓度接种96孔板，每孔100 μL，37℃、5%CO2培养箱中培养，长成单层后使用。将上述扩增好的病毒用10倍比系列稀释，稀释10个梯度，设置4个复孔，接种于已经长好细胞的96孔板中，并设空白对照，细胞对照，置病毒培养箱中培养，细胞出现90%以上病变时终止培养，按照CCK-8试剂盒的操作，测定吸光度OD值。根据Reed-Muench公式[15]计算病毒液的半数感染浓度（TCID50）。细胞存活率=（各组OD值-空白对照OD值）/（正常细胞OD值-空白对照OD值）×100%。细胞比距=（高于50%病变率-50%）/（高于50%病变率-低于50%病率）×100%。TCID50=Antilg[高于50%细胞病变效应法（CPE）百分率病毒稀释度+比距]。
1.6 细胞毒性的测定
将供试品药物（“1.3”中赤芍供试品和阳性对照药供试品，下同）用二倍比稀释10个浓度梯度，从“接种于已经长好细胞的96孔板中”起，操作同“1.5”，计算药物半数中毒浓度（TC50），并确定最大无毒浓度（TC0）。TC50=[Antilog（高于50%CPE百分率病毒稀释度+比距）]×C，C为第一孔药物终浓度。
1.7 对病毒直接杀灭作用
供试品从无毒浓度起，按二倍比稀释10个浓度梯度，与等体积100倍TCID50浓度的病毒液相互作用2 h，每孔100 μL，从“接种于己经长好细胞的96孔板中”起，操作同“1.5”，计算药物半数有效浓度（EC50）和治疗指数（TI）。EC50=[Antilog（高于50%CPE百分率病毒稀释度的值-比距）]×C，C为第一孔药物终浓度。TI=TC50/EC50。
1.8 对病毒预防作用
供试品从无毒浓度起，用2%维持液按二倍比稀释10个浓度梯度，每孔100 μL依次接种于已经长好细胞的96孔板中，2 h后，用PBS清洗，每孔再加入100 μL 100倍TCID50浓度的病毒液，接下来的步骤按照“1.7”操作计算EC50和TI。
1.9 对病毒穿入细胞后的阻断作用
己经长好细胞的96孔板中每孔加入100 μL 100倍TCID50浓度的病毒液，2 h后，用PBS清洗，供试品从无毒浓度起，按二倍比稀释10个浓度梯度，每孔100 μL接种，接下来的步骤按照“1.7”操作计算EC50和TI。
2 结果
2.1 病毒毒力的测定结果
通过实验测得，RSV、HSV-1、COX-B5、EV71的TCID50分别为10-5.36/mL、10-4.24/mL、10-4.52/mL、10-4.42/mL。
2.2 对病毒直接杀灭作用结果
水提取物抗RSV、COX-B5的效果好于75%乙醇提取物，其TI值分别为15.034和13.076；75%乙醇提取物抗HSV-1的效果与水提物效果相差不大，其TI值分别为10.994和10.100；对EV71无效，见表1～4。
2.3 对病毒预防作用结果
水提取物和乙醇提取物对四种病毒均无预防作用，阳性对照药利巴韦林对RSV、EV71、COX-B5的TI分别为16.230、24.296、15.516，阿昔洛韦对HSV-1的TI值为10.922，见表5～8。
2.4 对病毒穿入细胞后的阻断作用
水提取物和乙醇提取物对四种病毒均无穿入后阻断作用，阳性对照药利巴韦林对RSV、EV71、COX-B5的TI值分别为18.028、22.162、16.568，阿昔洛韦对HSV-1的TI值23.417，见表9～12。
3 讨论
本研究观察了赤芍水和75%乙醇提取物对病毒的直接杀灭作用、预防作用、穿入后抑制作用，发现赤芍两种方法提取物均无穿入后抑制作用、预防作用，但是具有直接杀灭作用，对此结果，笔者进行了推测：第一，对病毒没有预防作用的原因可能是赤芍提取物与细胞作用，细胞本身没有产生或产生较少的免疫因子，达不到抑制病毒的有效浓度；第二，对病毒没有直接杀灭作用的原因可能是，病毒穿入后，药物没有与细胞表面的受体蛋白结合进入细胞进行对病毒的杀灭，或者药物进去细胞的药物浓度过低，达不到抑制浓度；第三，对病毒有直接杀灭作用的原因可能是，病毒还未进入细胞或进入细胞较少时，药物就与病毒作用，将其杀死，水提物较75%乙醇提取物较好，作者推测，水较乙醇极性较大，且能较为完全地从药物中较大程度地提出药物成分，故其抗病毒效果较好。
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（收稿日期：2017-01-05 本文编辑：张瑜杰）