紫外线诱变在青霉素G生产菌种中的应用

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摘要：目的 探讨紫外线诱变在青霉素G生产菌种中的作用和使用价值。方法 采用细胞脱壁后再进行紫外线诱变处理的方法，选育高产优质菌种。结果 701菌种在发酵相对效价为108.2%、相对产量为106.4%均明显高于618菌株的100%、100%，结果具有统计学意义（P

关键词：紫外线诱变；青霉素G；生产菌种

青霉素G是抗菌素的一种，青霉素G是指通过从青霉菌培养液中提取的一种物质，这种物质的分子中含有青霉烷和能破坏细菌的细胞壁的成分，青霉素G能够在细菌细胞的繁殖期起到杀菌的作用，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素[1]。而在青霉素G在实际发酵生产菌种的制备过程中，常会因为细胞壁的存在而受到影响，细胞壁会降低对刺激性因子的敏感性[2]。为了克服这一难题，本研究通过采用紫外线诱变选育高产优质菌种，更能加快高产特性菌株的筛选过程，是一种有效的诱变筛选方法，现报道如下。

1资料与方法[3]

1.1一般资料

1.1.1菌株 采用产黄青霉菌618。

1.1.2培养基 ①斜面培养基（%）培养基由以下成分组成：甘油0.75、甘油蜜糖0.75、酵母浸处粉0.5、NaCL 1、CaSO4 0.025、琼脂2.7；pH 6.8。②菌丝培养基（%）由以下成分组成：玉米浆6.1、蔗糖2.0、CaCO3 0.5；pH 5.8。③再生培养基（%）由以下成分组成：NaNO3 0.3、MgSO4・7H20 0.05、FeSO4-・7H20 0.001、KCL 0.05、KH2PO4 0.1、葡萄糖4、酵母膏0.2、琼脂2.7、pH 6.8。④稳定剂采用0.7M NaCL。

1.1.3酶 采用纤维素酶+cellulase R-10。

1.2方法

1.2.1原生质体的制备包括菌种培养、胞壁酶处理，具体步骤如下：菌体培养受限将618#菌种新鲜斜面加入一定量的无菌水中，将菌株孢子刮下再制成孢子悬液，再经过玻璃珠打散过滤后取1 mL，将这1 mL袍子悬液接种于40 mL的菌丝培养液中。条件要求为：28℃，240 rpm条件下培养36 h，最后得到菌丝体。胞壁酶处理使用4层无菌纱布过滤菌丝培养液以收集菌丝体，将收集后的菌丝体再使用无菌水洗2～3次，接着再使用稳定剂洗两次，取1 g左右的菌丝体悬浮于5 mL稳定剂中，再加入5 mg纤维素酶和5 mg cellulase R-10，将其置入30℃恒温水浴振荡摇床60 rpm，时间为1.5～2 h。

1.2.2紫外线诱变处理原生质体使用紫外线诱变处理原生质体，操作过程中取原生质体悬浮液适量，并进行紫外线（253.7nm）诱变处理，分别照射25″和40″。

1.2.3高产菌株的检出将经过紫外线诱变处理后的原生质体悬浮液涂于再生培养基平皿中，恒温培养7 d。带菌落长出后，挑选结构紧密，形状规则的单菌落传斜面培养后，进行发酵摇瓶的筛选。

1.3疗效观察 观察紫外线诱变对变异情况的影响，比较701菌株与618菌株两种菌株的发酵相对效价与相对产量的变化，比较701菌株与618菌株两种菌株限氧条件下发酵效价的变化情况，比较701菌株与618菌株两种菌株单位菌丝合成能力。

1.4统计学方法 采用SPSS 11.0软件进行统计学处理，计量资料采用t检验，P

2实验结果

2.1比较紫外线照射时间对原生质体致死作用的影响本研究通过对产黄青霉菌618进行紫外线处理，并分别采用25″和40″的时间计量处理原生质体，结果发现，紫外线照射25″时致死率为75%，紫外线照射40″时致死率为82.8%，结果具有统计学意义（P

2.2比较两种菌株发酵相对效价与相对产量的变化经摇瓶发酵筛选得到的701菌种，701菌种在发酵相对效价为108.2%、相对产量为106.4%均明显高于618菌株的100%、结果具有统计学意义（P

2.3比较两种菌株在限氧条件下发酵效价的稳定性本研究通过采用改变瓶口纱布层数来改变供氧的方法考查两种菌株在限氧条件下发酵效价的稳定性。瓶口纱布层数为6层时，701菌株为108.4%、8层时为109.15、10层时为107.2%，均维持在较高水平，无显著变化，而618菌株分别为100%、93.1%、80.7%，随着氧气减少，发酵效价也随之减少，结果具有统计学意义（P

2.4比较两种菌株单位菌丝合成能力单位菌丝合成能力是考查一个新菌株是否有推广生产价值的主要参数之一，在本研究中，701菌株单位菌丝合成能力为105.2%明显高于618菌丝的100%，结果具有统计学意义（P

2.5比较两种菌株的稳定性将701菌株传代后其F1代、F2代、F3酵效价与总产量均无显著变化，结果具有统计学意义（P

3讨论

本研究结果表明，产黄青霉菌在细胞壁去除之后，对紫外线的敏感度也随之增强，相对更长时间的紫外线照射，菌株存活个体变异概率也随之升高，为培育新的菌株提供更多可能性。本研究通过摇瓶筛选得到701菌株，该菌株相比于618菌株发酵效价和总产量有一定程度提高，对氧的需求也相对降低，值得推广应用。

参考文献：

[1]熊宗贵.发酵工艺与原理[M].中国科学技术出版社，2008：31.

[2]翁艳军.青霉素产生菌的原生质体融合[J].中国抗生素杂志，2009，6（3）：129-130.

[3]谢虹，周元元，梁建生.法夫酵母高产虾青素复合诱变育种的研究[J].食品研究与开发，2010，10（9）：312.