阿托伐他汀钙对野百合碱介导肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

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[摘要] 目的 探阿托伐他汀钙（ATV）对野百合碱诱导的肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖与凋亡作用及其分子机制。 方法 将PASMCs随机分为对照组、野百合碱组、野百合碱+ATV组以及野百合碱+ATV+SC79组。应用MTT法检测PASMCs细胞的生长情况，荧光TUNEL法分析PASMCs细胞凋亡情况，并用免疫印迹法检测PASMCs细胞中PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2以及Bax表达的变化。 结果 与对照组比较，野百合碱组PASMCs细胞增殖明显增强（P < 0.01），ATV能明显抑制MCT诱导的PASMCs细胞增殖（P < 0.01），且ATV可明显降低PI3K/AKT通路蛋白及Bcl-2蛋白的表达，而升高Bax蛋白的表达，诱导PASMCs细胞凋亡（P < 0.01）。此外，AKT特异性激动剂SC79能逆转ATV的作用。 结论 ATV通过作用于PI3K/AKT信号通路调控PASMCs细胞增殖，诱导细胞凋亡，为肺动脉高压治疗提供新的治疗策略。

[关键词] 肺动脉高压；阿托伐他汀钙；野百合碱；PI3K/AKT；凋亡

[中图分类号] R543.204 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（a）-0008-05

Effect of Atorvastatin Calcium on the proliferation and apoptosis of monocrotaline-induced pulmonary artery smooth muscle cells

HUANG Junxia1 LI Ying2 FAN Yuhua3 TU Yingfeng4

1.The Third Department of Internal Medicine， Kaihua People's Hospital of Quzhou City， Zhejiang Province， Kaihua 324300， China； 2.the Second Department of Internal Medicine， Kaihua People's Hospital of Quzhou City， Zhejiang Province， Kaihua 324300， China； 3.College of Pharmacy， Harbin Medical University， Heilongjiang Province， Daqing 163000， China； 4.Department of Cardiology， the Fourth Hospital Affiliated to Harbin Medical University， Heilongjiang Province， Daqing 150001， China

[Abstract] Objective To investigate the effects and molecular mechanism of Atorvastatin Calcium （ATV） on the proliferation and apoptosis of pulmonary artery smooth muscle cells （PASMCs） induced by monocrotaline. Methods The PASMCs were randomly assigned into four groups： control group， monocrotaline group， monocrotaline+ATV group and monocrotaline+ATV+SC79 group. The MTT assay was used to assess the proliferation of PASMCs cells. And the PASMCs apoptosis was analyzed by TUNEl apoptosis assay kit. Furthermore， the expression of PI3K， AKT， p-AKT， Bcl-2 and Bax was determined by the Western blot assay. Results Compared with control group， the proliferation of PASMCs was obviously increased in monocrotaline group （P < 0.01）， while the ATV could inhibit the effect of monocrotaline in PASMCs （P < 0.01）， in addition， the expression of PI3K/AKT signal proteins and Bcl-2 protein in monocrotaline+ATV treated PASMCs cells were decreased significantly， while the expression of Bax was increased significantly， and ATV could induce apoptosis in PASMCs （P < 0.01）. However， the SC79， a unique specific AKT activator， could reverse the effect of ATV on PASMCs. Conclusion ATC has protective effects on the proliferation and apoptosis of pulmonary artery smooth muscle cells via PI3K/AKT signal pathway， which might be a novel strategy for treating pulmonary artery hypertension.

[Key words] Pulmonary artery hypertension； Atorvastatin Calcium； Monocrotaline； PI3K/AKT； Apoptosis

肺动脉高压（pulmonary artery hypertension，PAH）是一组由多种病因累及肺血管床而引起肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增生和肺动脉结构重塑以及肺动脉压力升高为特征的一种临床综合征[1]。PAH一旦形成，临床上尚无行之有效的根治措施。因此，PAH有着“心血管领域的癌症”之称[2]。肺血管重塑在PAH发病中起关键性作用，且PASMCs异常增殖是构成肺动脉血管重塑的主要病理生理基础[3]。因此，探索介导PASMCs异常增殖的分子机制及相关药物干预是PAH领域的研究热点。

研究证实，阿托伐他汀钙（ATV）通过钙调通道差异性表达来减弱野百合碱诱导的PAH大鼠的肺动脉重构[4]。Guerard等[5]证明普伐他汀可抑制野百合碱诱导的PAH进展，改善肺动脉内皮依赖性舒张功能。此外，Taraseviciene-Stewart等[6]研究提示辛伐他汀能够显著降低平均肺动脉压力，缓解右室肥厚，其机制可能与抑制凋亡蛋白Caspase-3激活、减少肺微血管内皮细胞凋亡有关。信号转导通路磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）是许多生命活动中关键的信号转导分子，参与调控细胞分裂p分化p凋亡、增殖及迁移等活动。经ATV后处理可激活PI3K/AKt信号通路，减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤[7]。但ATV是否参与调控PASMCs的生物学行为仍不十分清楚。因此，本研究旨在探讨ATV对野百合碱诱导的PASMCs增殖的调控作用，探讨PI3K/AKT信号通路是否参与ATV逆转野百合碱诱导的PASMCs增殖，从而为ATV治疗PAH提供新思考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

野百合碱购于上海纯优生物科技有限公司；ATV购于上海研生实业有限公司；双抗购自友康基业生物科技有限公司；细胞培养液DMEM-F12购自Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix染料荧光定量Real-time PCR试剂盒购自美国Applied Biosystems公司；胎牛血清购自Gibco公司；蛋白电泳仪、PVDF膜购于BIO-RAD公司；紫外分光光度仪购于美国BIO-RAD公司；Odyssey红外荧光扫描成像系统购于美国LI-COR公司；抗PI3K、AKT、Bcl-2及Bax抗体购自Cell Signaling Technology公司；6孔板和96孔板购自上海拜力生物科技有限公司；共聚焦显微镜FV300购自日本 Olympus公司。Image-Pro Plus 6.0图像分析系统购于Media Cyberneties公司。

1.2 PASMCs细胞培养

Wistar乳鼠购于哈尔滨医科大学附属第二临床医院动物中心。动物实验研究遵循哈尔滨医科大学所制订的有关实验动物保护和使用的指南，并经实验动物伦理委员会批准（批准文号：2009104）。本研究采用组织块种植法：取Wistar乳鼠，脱颈椎处死后，消毒后剖开胸腔，迅速取出心肺置于D-Hanks液中。迅速剥离肺动脉主干及左右肺动脉，用D-Hanks液反复漂洗。剥除血管外膜的纤维脂肪层，沿血管外侧纵向剪开，将血管内膜面向上，用刀片去除内皮细胞，在DMEM-F12培养液中漂洗2次。将中膜剪成0.5 mm×1 mm小块，移入培养瓶内，组织块之间距约0.5 cm。然后将培养瓶翻转，置于37℃、CO2培养箱中。1 h后轻轻翻转并加入含20%胎牛血清的DMEM-F12培养液，使组织块浸泡在培养液中，置于37℃、CO2培养箱中静置培养1周。1周后再观察及换液。此后，改用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养液，每隔3 d换液1次。当大部分组织块长出细胞晕，并且相邻组织块间细胞晕融合时，振摇培养瓶，使组织块脱壁，吸除培养液和脱壁组织块，加入2～3 mL无菌D-Hanks液清洗2次后，用0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化分散细胞，进行传代培养。通过三瓶置换法纯化PASMCs。第3～6代细胞用于后续实验。

1.3 药物干预

将PASMCs细胞分为对照组、野百合碱组、野百合碱+ATV组以及野百合碱+ATV+SC79组。野百合碱组PASMCs细胞培养液中加入野百合碱（1 μmol/L）；对照组给予等剂量的生理盐水；野百合碱+ATV组在培养液中加入1 μmol/L野百合碱的同时给予ATV（10 μmol/L）；野百合碱+ATV+SC79组在培养液加入1 μmol/L野百合碱的同时给予ATV（10 μmol/L）和SC79（AKT特异性激动剂，150 μmol/L）。继续培养48 h后用于后续的实验。

1.4 MTT实验

收集各组PASMCs细胞，以3×103个细胞/孔接种于96孔培养板，每孔培养液总量200 μL，于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养48 h，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4 h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2～3遍后，再加入含MTT的培养液。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。同时设置空白对照孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），每组设定3个复孔。以加药前的吸光值作为100%，各时间点与其比较。

1.5 TUNEL法检测细胞凋亡

将爬满PASMCs细胞的载玻片用PBS洗涤1次。室温下晾干，利用4%多聚甲醛固定PASMCs细胞30 min，再用PBS冲洗载玻片2次，每次5 min。4 mL 3%H2O2加36 mL甲醇配制的封]液封闭细胞10 min。PBS洗2次，每次5 min。加入穿透液（通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制），冰上（2～8℃）促渗2 min。加入Roche原位细胞死亡检测试剂盒进行TUNEL染色，每张载玻片加50 μL TUNEL反应混合液，放入避光湿盒中，于37℃孵箱中孵育1 h。在暗室中利用PBS洗玻片2次，每次5 min。加入DAPI进行细胞核染色，37℃培养箱孵育10 min。用抗荧光淬灭封片液进行封片，置于荧光显微镜下观察，计算每组细胞的凋亡率。

1.6 免疫印迹（Western blot）分析PI3K、AKT、Bcl-2以及Bax蛋白的表达

将各组细胞培养瓶置于冰上，PBS洗涤细胞3次，每个培养瓶中加入适量细胞裂解液，超声裂解组织，每次工作20 s，间歇30 s，反复5次，之后放置冰上裂解30 min，13 500 r/min高速离心机于4℃条件下离心15 min，收集上清液于-80℃冰箱中保存。取1 μL悠酚τBCA试剂盒测定细胞中蛋白质浓度。依次配制分离胶和积层胶，每个孔道中加入80～100 μg的样品量。电泳槽联通电泳仪电源，90V电压跑浓缩胶。待测样品和进入分离胶后，电压改为120V，电泳60～90 min后，溴酚蓝快迁移出分离胶时停止电泳。按照“纤维垫-滤纸-凝胶-硝化纤维膜-滤纸-纤维垫”的顺序由下至上排列安装好，恒定300 mA电流，转膜时间为80 min。取出NC膜置于5%的脱脂奶粉中，在4℃的环境中封闭2 h。分别用一抗PI3K抗体（1∶200）、AKT（1∶500）、p-AKT（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）、GAPDH（1∶1000）在4℃冰箱中孵育过夜。取出孵育过抗体的NC膜，用PBS-T洗涤3 次，每次10 min。然后用（1∶4000）稀释的红外荧光标记二抗均匀铺展在NC膜上，避光孵育1 h后用PBS-T洗涤3次，每次10 min。最后用Odyssey红外荧光扫描成像系统进行检测，计算其灰度值。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件分析数据，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ATV能明显抑制PASMCs细胞增殖

MTT实验检测结果表明，与对照组（1.03±0.04）比较，在野百合碱能诱导作用下，PASMCs细胞的增殖明显上调（1.68±0.07），差异有高度统计学意义（P < 0.01），而ATV能明显逆转野百合碱诱导PASMCs细胞的增殖的能力（0.55±0.18）（P < 0.01）。

2.2 ATV能促进PASMCs细胞的凋亡

TUNEL染色法结果证明，与对照组比较，PASMCs细胞经过ATV处理后，被TUENL染色染成绿色的凋亡细胞明显增多，而野百合碱处理组不会引起细胞凋亡数量的增加（P < 0.01）（图1，封四）。

2.3 ATV能抑制PASMCs细胞中PI3K/AKT信号通路

Western blot检测结果显示，与对照组及野百合碱组比较，野百合碱+ATV组可以显著抑制PASMCs细胞中PI3K和AKT的表达，差异有高度统计学意义（P < 0.01）（图2）。

2.4 AKT特异性激动剂SC79逆转ATV的作用

Western blot检测结果显示，与野百合碱+ATV组比较，AKT特异性激动剂SC79可以显著逆转ATV抑制PASMCs细胞中AKT的表达，差异有高度统计学意义（P < 0.01）（图3）。

2.5 ATV能调控PASMCs细胞中凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达

Western blot检测结果显示，与对照组及野百合碱组比较，野百合碱+ATV组可以显著抑制PASMCs细胞中Bcl-2的表达，促进Bax蛋白的表达，差异有高度统计学意义（P < 0.01）（图4）。

3 讨论

PAH是慢性阻塞性肺疾病发展成肺源性心脏病的重要环节，其发病机制尚未完全阐明。本研究采用野百合碱体外诱导PASMCs增殖，研究ATV对PASMCs增殖及诱导凋亡中的作用。研究结果提示：①野百合碱在体外诱导PASMCs增殖，且ATV能明显抑制野百合碱诱导增殖的能力。②ATV能明显诱导PASMCs发生凋亡。③ATV可能通过抑制PI3K/AKT信号通路而发挥作用。④ATV能明显诱导促凋亡蛋白Bax的表达，而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。

ATV是一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，可以有效降低体内胆固醇合成[8-10]。近年来大量研究发现ATV还存在着除了降低血清胆固醇水平的特性之外的“多效性”作用。这些作用包括抗氧化、刺激内皮祖细胞分化、改善内皮功能、抗炎等[11-13]。此外，ATV可有效抑制血管平滑肌细胞增生，稳定动脉斑块，改善心肌重构，抗血小板以及抗凝等[14]。然而，ATV在抑制PAH发生发展方面的研究较少，本研究提示ATV可能通过诱导PASMCs发生凋亡而发挥抗凋亡的作用。

PI3K/AKT信号通路是调节细胞功能的重要的信号转导通路[15]，包括生长因子在内的多种刺激能够激活血管平滑肌细胞的PI3K，进而提高细胞内IP含量，然后活化AKT，参与调控细胞的迁移、增殖和凋亡等[16]。文献报道，PI3K/AKT信号通路在血管平滑肌细胞增殖的发生发展过程中起着非常重要的作用[17]。近年来有研究证实，生长因子及缺氧等可激活PASMCs中PI3K/AKT信号转导通路，诱导PASMCs增殖；而抑制PASMCs中PI3K/AKT信号转导通路，则可抑制生长因子及缺氧刺激的PASMCs增殖，提示PI3K/AKT信号通路可能特异性介导PASMCs的增殖[17-18]。Wang等[19]进一步证实PI3K/AKT信号转导通路可通过特异性调控细胞周期蛋白的表达，促进细胞周期进展，诱导PASMCs增殖，且活体动物研究进一步证实抑制PI3K/AKT信号通路可预防及治疗多种诱因导致的PAH的发生。Chao等[20]报道，PI3K/AKT和ERK/p38 MAPK信号通路的平衡决定了PASMCs表型的变化。本研究发现ATV可能通过抑制PI3K/AKT信号转导通路而发挥抑制PASMCs增殖的作用。本研究免疫印迹检测结果显示，与对照组比较，ATV能够增加抑制AKT蛋白的磷酸化，并且诱导促凋亡蛋白Bax的表达而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。TUNEL实验进一步证明我们的结论，ATV能够诱导PASMCs发生凋亡。