胃癌患者外周血CD4+CD25+CD127lo/-调节性T细胞的表达及意义

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【摘要】目的：探讨胃癌患者外周血中cd4+cd25+cd127lo/-调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)的表达及意义。方法：采用流式细胞术检测26例胃癌患者、30例胃溃疡患者和20例健康志愿者外周血中CD4+CD25+CD127lo/-Treg、细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)和NK细胞，采用ELISA法检测血清中γ-干扰素(interferon γ，IFN-γ)的表达水平。结果：胃癌患者外周血中CD4+CD25+CD127lo/-Treg占CD4+T淋巴细胞的百分比为(6.12±2.08)%，高于胃溃疡患者和健康志愿者(P均

【关键词】胃癌；CD4+CD25+CD127lo/-调节性T细胞；CTL；NK细胞；γ-干扰素

文章编号：1009-5519（2007）17-2537-03 中图分类号：R446 文献标识码：A

Expression of CD4+CD25+CD127lo/- T cells in gastric cancer patients and its significance

XU Rong-wei

（Department of Clinical Laboratories，The Third People's Hospital of Leqing，Zhejiang 325604，China）

【Abstract】Objective：To evaluate the expressions of CD4+CD25+CD127lo/- T cells in peripheral blood from patients with gastric cancer. Methods：26 patients with gastric cancer，30 patients with gastric ulcer and 20 healthy volunteers were included in this study. The proportion of CD4+CD25+CD127lo/- T cells population in CD4+ T cells was evaluated by flow cytometric analysis. The proportion of CTL and NK cells population in lymphocytes was determined by flow cytometric analysis. IFN-γ was measured by ELISA. Results：The population of CD4+CD25+CD127lo/- T cells in peripheral blood from patients with gastric cancer accounted for (6.12±2.08)% of CD4+ T lymphocytes，and was significantly higher in comparison with that in patients with gastric ulcer and in healthy volunteers(P

【Key words】Gastric cancer；CD4+CD25+CD127lo/- regulatory T cells；CTL；NK cell；IFN-γ

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国目前每年新发病例超过40万人，因胃癌死亡患者30万人，死亡率居恶性肿瘤首位。研究表明，肿瘤发生与机体免疫逃避有关，调节性T细胞（Treg）具有无能性和免疫抑制性，能降低体内具有抗肿瘤活性的细胞毒性T细胞（CTL）和天然杀伤细胞（NK）细胞水平，使机体免疫失去杀伤肿瘤突变细胞的能力。研究发现用CD4+CD25+CD127lo/-Treg代表天然存在的Treg，能区别自身活化效应T细胞[1]。我们采用流式细胞术检测了26例胃癌患者外周血中CD4+CD25+CD127lo/-Treg、CTL和NK，采用ELISA法检测了血清中IFN-γ的表达水平。

1 材料与方法

1.1 研究对象：胃癌患者知情并自愿提供标本26例，其中男18例，女8例，年龄39～75岁，平均（55.2±9.5）岁。胃溃疡患者知情并自愿提供标本30例，其中男21例，女9例，年龄34～61岁，平均（43.8±7.1）岁。健康志愿者知情并自愿提供标本30例，其中男20例，女10例，年龄30～52岁，平均（38.9±7.6）岁。

1.2 主要试剂和仪器：小鼠抗人CD25-FITC、CD127-PE、CD4-PE-Cy5、CD28-FITC、CD8-PE、CD3-FTIC、CD56-PE及同型无关对照均为美国BD Pharmingen公司产品。人IFN-γELISA试剂盒为奥地利Bender MedSystems公司产品。FACSCalibur型流式细胞仪购自美国BD公司，酶标仪ELx800购于美国BIO-TEK公司。

1.3 方法

1.3.1 样本采集及处理：所有受试对象抽取静脉血4 ml，手术患者术后1周取血，其中2 ml用EDTA抗凝，室温保存，24小时内用流式细胞仪分析；2 ml分离血清，-70℃保存，用于IFN-γ的检测。

1.3.2 流式细胞仪分析及细胞因子检测：取4个试管，分别加mouse IgG1-FITC/mouse IgG1-PE/CD4-PE-Cy5、CD25-FITC/CD127-PE/CD4-PE-Cy5、CD28-FITC/CD8-PE、CD3-FITC/CD56-PE，每管加100 μl抗凝全血后混匀避光孵育30分钟，溶血后PBS洗2次，流式细胞仪分析其外周血CD4+CD25+CD127lo/-Treg占CD4+淋巴细胞百分比、CTL细胞和NK细胞占总淋巴细胞的百分比；酶标仪检测血清中IFN-γ的含量。

1.4 统计学处理：测得数据用x±s表示，采用SPSS13.0统计软件，3组间比较采用LSD方差分析，关联分析采用线性相关分析，手术前后比较采用配对t检验。

2 结果

2.1 胃癌患者外周血中CD4+CD25+CD127lo/-Treg、CTL、NK细胞、IFN-γ的表达见表1。胃癌患者、胃溃疡患者和健康志愿者3组的CD4+CD25+CD127lo/-Treg表达见图1。胃癌患者外周血中CTL与CD4+CD25+CD127lo/-Treg之间存在负相关(r=-0.308，P=0.039)，NK细胞与CD4+CD25+CD127lo/-Treg之间存在负相关(r=-0.415，P=0.014)。胃癌患者外周血清中IFN-γ与CD4+CD25+CD127lo/-Treg存在负相关(r=-0.371，P=0.037)。与胃溃疡患者比较除CTL外，其它指标均具有统计学意义（P

2.2 手术前后胃癌患者CD4+CD25+CD127lo/-Treg 、CTL、NK细胞和IFN-γ的表达：见表2。

3 讨论

大多数CD4+细胞属于Thl或者Th2亚群，而有5％左右不属于两者中任何一个，称为CD4+CD25+Treg。CD4+CD25+Treg具有下列特征：（1）具有低反应性和免疫抑制性两大特点，在体外很难扩增和繁殖，能够抑制CD4+和CD8+T细胞的活化与增殖；（2）它的活化是抗原特异性，但可非特异性抑制同种抗原，可以抑制对自身抗原或外来抗原的异常免疫反应；（3）活化以后分泌大量IL-10和TGF-β，抑制Thl介导的免疫和炎症、Th2介导的抗体产生以及CD8+CTL的活性。

人Treg表型非常复杂，现在公认表达核转录因子Foxp3，但由于其表达在细胞内，检测时需要先固定破膜，不能分选活细胞做后续功能抑制实验，无法证实其免疫活性，所以一般用CD4+CD25high代表Treg[2]。但这种检测方法存在一个明显的缺点，CD25high的荧光强度设门各个实验室非常随意，没有一个明确的标准。最近研究发现，在新鲜分离的正常人外周血T细胞中CD127和Foxp3表达呈负相关，87%的CD25+CD127lo/-Treg高表达FOXP3，自身活化的效应T细胞高表达CD127，因而可用CD127区分这两种细胞，现今认为CD4+CD25+CD127lo/-是天然产生Treg细胞最好的细胞膜标志[1，3]。本研究中健康志愿者外周血CD4+CD25+CD127lo/-Treg占CD4+T淋巴细胞为（4.78±1.31）%，比之前很多研究人员用CD4和CD25标记检测的Treg略高[4]，可能是改进了CD25的设门方法。在小鼠动物试验中，去除Treg能够提高小鼠对多种不同来源肿瘤细胞的免疫排斥作用，提示Treg能够抑制抗肿瘤免疫反应。同时在临床研究中发现，多种不同来源的肿瘤患者存在数量过多的Treg细胞，且跟其肿瘤进展相关[5]。本研究显示，胃癌患者外周血中的CD4+CD25+CD127lo/-Treg高于胃溃疡患者和健康志愿者，手术后患者CD4+CD25+CD127lo/-Treg的数量明显下降，提示肿瘤负荷与胃癌患者体内CD4+CD25+CD127lo/-Treg的数量有关。现今认为，肿瘤相关抗原能诱导Treg富集于肿瘤及其周围淋巴结，导致平衡向有利于自身耐受的方向发展，其确切关系尚未完全明了。

众所周知，CTL和NK细胞是体内两种主要的肿瘤杀伤作用细胞，产生IFN-γ等细胞因子杀伤肿瘤突变细胞。CD4+CD25+CD127lo/-Treg能抑制CTL细胞和NK细胞的表达和活性。本研究发现，胃癌患者体内的CTL、NK细胞及IFN-γ均低于正常，与CD4+CD25+CD127lo/-Treg呈负相关。手术后除CTL无明显改变外，NK细胞和血清中IFN-γ含量均增多。推测Treg可能通过以下方式抑制CTL和NK细胞，其一是释放抑制性细胞因子TGF-β1抑制两种细胞的溶细胞活性[6]，其次是抑制两种细胞具有杀伤的细胞因子的释放，主要是IFN-γ等。

参考文献：

[1] Liu W，Putnam AL，Xu-Yu Z，et al.CD127 expression inversely cor-relates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells[J]. J Exp Med，2006，203(7):1701.

[2] 徐静玮，李向培，李 庆，等.调节性T细胞亚群变化与五种自身免疫性疾病的关系[J].中华医学检验杂志，2006，29（3）：245.

[3] Seddiki N，Santner-Nanan B，Martinson J，et al. Expression of inter-leukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regu-latory and activated T cells[J]. J Exp Med，2006，203(7):1693.

[4] 孙可歆，李永哲，赵 臣，等. 炎症性肠病患者外周血CD4+ CD25+Treg细胞的表达及意义[J].中国医学检验杂志，2006，7（l）：1.

[5] 刘俊田，岳 杰，任秀宝，等.乳腺癌患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞的检测及意义[J].中华肿瘤杂志，2005，27（7）：423.

[6] Chen ML，Pittet MJ，Gorelik L，et al. Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-β signals in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(2): 419.

收稿日期：2007-04-09