淋巴细胞分布研究论文
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【摘要】本研究应用小鼠GVHD模型探讨异基因T淋巴细胞在移植受体体内的迁移和分布。将C57BL/6的骨髓细胞和转基因荧光C57BL/6小鼠的脾淋巴细胞输入经8Gy全身照射的BALB/c小鼠，建立eGFP标记供体淋巴细胞的GVHD小鼠模型；应用荧光显微镜和流式细胞术观测GVHD模型中eGFP细胞的分布；ELISA法检测GVHD靶组织中趋化因子MIP-1α水平的改变。结果表明：①输入脾细胞和骨髓细胞第8天后出现GVHD临床及病理表现;②GVHD模型中，受体鼠肝、皮肤、肠、脾、肺、舌有eGFP细胞浸润;③GVHD小鼠肝、脾eGFP细胞中CD4、CD8细胞比例均逐渐升高;④GVHD鼠脾、肝组织中MIP-1α水平升高，脾中MIP-1α水平高峰出现于移植后第3天，肝中MIP-1α水平高峰出现于移植后第7天。结论：除肝、肠、皮肤外，肺、舌可能也是GVHD靶器官。肝、脾组织中供体淋巴细胞浸润伴随MIP-1α水平的升高。
【关键词】小鼠GVHD模型;T淋巴细胞；增强型绿色荧光蛋白；巨噬细胞炎症蛋白
MigrationandDistributionofAllogeneicTLymphocytesinOrgansofGraft-Versus-HostDiseaseMouseModel
AbstractThisstudywasaimedtoinvestigatethemigrationanddistributionprocessesofallogeneicdonorTlymphocytesintheorgansofrecipientmice.GVHDmodelwasestablishedbytransfusionofthesplenocytesofeGFPtransgeneicC57BL/6micetogetherwithbornmarrowcellsharvestedfromC57BL/6miceintoBALB/cmiceunderwent8.0Gytotalbodyirradiation.ThemigrationandhomingofeGFPcellsweretrackedbystereo-fluorescentmicroscopyorinvertedfluorescentmicroscopyandflowcytometry.Theenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)wasperformedonsupernatantsfromthetissuehomogenatestodetecttheamountofMIP-1α.TheresultsindicatedthatGVHDclinicalmanifestationandpathologicalchangesoforgansappearedonday8posttransplantation.eGFP-positivedonorTcellsinrecipientorganswereobservedbyinvertedfluorescencemicroscopeinfrozensection,orbystereo-fluorescencemicroscopyinlivingorgans,suchasliver,spleen,skin,lungs,bowels,andtongue.ThehighestexpressionofMIP-1αwasonday7posttransplantationintheliver(491.3±32.1pg/ml),andday3posttransplantationinthespleen(881.5±45.2pg/ml)，respectively(P<0.05).ItisconcludedthatGVHDwasinducedbysplenocytesofeGFPtransgeneicC57BL/6mice.eGFPcellsintheorganscanbeobservedbyfluorescentmicroscopy.InthisGVHDmodel,donorTcellsproliferateandinfiltrateinliver,skin,bowels,aswellaslungsandtongue.MIP-1αmaybeinrelationwiththeinfiltrationofTlymphocytesinliverandspleen.
KeywordsmurinGVHDmodel;Tlymphocytes;splenocytes;enhancedgreenfluorescenceprotein;macrophageinflammatoryprotein-1（MIP-1α）
移植物抗宿主病（graft-versus-hostdisease,GVHD）是异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）临床应用的主要并发症之一。目前公认GVHD是由供体T淋巴细胞在宿主体内被激活,并攻击靶组织所引起，但对异基因T淋巴细胞在受体体内的迁移、组织分布及激活过程仍不甚清楚，GVHD累及器官的范围也存在一定争议。我们建立了增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,eGFP)标记供体淋巴细胞的GVHD小鼠模型，观察了GVHD模型中eGFPT淋巴细胞的分布与激活，为GVHD防治研究提供基础资料。
材料和方法
实验动物
BALB/c（H-2Kd）雌性小鼠、C57BL/6雄性小鼠（H-2Kb）均为6-8周龄，购自上海生命科学院实验动物中心。eGFP-Tg-C57BL/6雄性小鼠（H-2Kb），6-8周龄，由第二军医大学细胞生物学教研室提供。
实验材料
PElabeledanti-mouseCD4，PE-cy5labeledanti-mouseCD8为Biolegend公司产品。小鼠MIP-1αELISA检测试剂盒为R&D公司产品。
供体小鼠骨髓、脾细胞悬液的制备与检测
颈椎脱位法处死C57BL/6及eGFP-Tg-C57BL/6小鼠，无菌取其双侧的股骨和脾。用不含有牛血清的RPMI1640培养液制备骨髓细胞悬液及脾细胞悬液。以PBS重悬细胞，调整浓度至107/ml。0.4%台盼蓝染色提示骨髓细胞悬液及脾细胞悬液中活细胞在95％以上。流式细胞术检测骨髓细胞和脾细胞中CD4T、CD8T淋巴细胞百分比。
GVHD模型的建立
用60Co-γ线全身照射受体BALB/c雌性小鼠(8.0Gy,剂量率为0.5Gy/min)，于6-12小时内每只鼠经尾静脉输入8×106骨髓细胞(BMC)15×106脾细胞(SC)。分组如下：A组18只BALB/c鼠，输C57BL/6鼠BMCeGFP-Tg-C57BL/6鼠SC；B组5只BALB/c鼠，输C57BL/6鼠BMC；C组BALB/c鼠5只，输eGFP-Tg-C57BL/6鼠BMCC57BL/6鼠SC。
造血重建
移植后第1、3、5、11、13天，检测外周血细胞数。移植后第13天，制备骨髓细胞悬液片，在OlympusⅨ70倒置荧光显微镜下观察。骨髓细胞悬液染色体检查采用短期培养法，显微镜下计数Y染色体的分裂相比例，共观察10个分裂相。
GVHD观察
死亡时WBC<0.5×109/L为移植失败，WBC>1.0×109/L并具有以下症状者为GVHD发生:倦怠、纳差、体重减轻、弓背、乱毛、脱毛、腹泻甚至死亡。以25天为观察期限，观察小鼠的GVHD发生情况和生存时间。取肝、肠、皮肤组织,用4%中性甲醛固定,石蜡包埋，常规切片,HE染色,光学显微镜下观察。
eGFP淋巴细胞在小鼠体内的分布
取A组小鼠，麻醉后，去毛，切开鼠胸腹部，暴露肝、脾、肠、肺、肾，皮肤、舌、脑、骨等。用LeicaMZFLⅢ立体荧光显微镜观察，拍照，曝光时间0.4-1.9秒。取A组小鼠，麻醉，PBS灌注后，切取小鼠的肝、脾、单个肾脏、肠、皮肤、肺、脑实质、舌、肾脏等，冰冻切片（厚10μm），在OlympusⅨ70倒置荧光显微镜下观察绿色荧光。以未输入eGFP细胞小鼠的各组织及冰冻切片分别作对照，排除背景荧光。
MIP-1α水平和T细胞亚群检测
取肝、脾、单个肾脏，置于200目不锈钢网中轻轻碾碎，以1mlPBS分别收集细胞，500×g离心6分种，取上清，行MIP-1αELISA检测，按试剂盒说明书操作，测450nmOD值。采用CurveExpert1.3软件作标准曲线，计算样本OD值对应的浓度值。流式细胞术检测肝、脾、肾细胞悬液中eGFP细胞百分数及以eGFP细胞设门的CD4、CD8细胞百分数。
统计处理
数据用SPSS10.0统计软件处理,生存分析采用Kaplan-Meier分析方法；样本均数间比较采用独立样本t检验。
结果
小鼠骨髓细胞和脾细胞中CD4、CD8细胞百分比
检测结果见表1。由表1可见，eGFP-Tg-C57BL/6小鼠脾细胞（SC）悬液中CD4T或CD8T淋巴细胞含量与C57BL/6小鼠相似，CD4T均在20％左右，CD8T均在13％左右。据此推测两种小鼠在引发GVHD方面没有区别。这两种小鼠骨髓细胞中T淋巴细胞含量均极少，约为2％。因此，单输骨髓细胞可能不足以引发GVHD。
移植后造血重建
移植后第3天WBC降至最低值，第8天后WBC恢复至大于1.0×109，第13天WBC恢复至3.0×109以上。移植后第13天后C组鼠的骨髓细胞大多为eGFP细胞(图1)，说明其来源于供体eGFP-Tg-C57BL/6鼠。染色体检查显示受者雌性小鼠骨髓细胞10个分裂相中，8/10-10/10可见Y染色体。Table1.PercentagesofCD4,CD8cellsinbonemarrowcells(BMC)andsplenocytes(SC)ofthemice（略）
eGFP淋巴细胞在小鼠体内的分布
立体荧光显微镜、荧光倒置显微镜观察显示，A组小鼠肝、皮肤、肠、脾、肺、舌有eGFP细胞浸润(图2)；肾、脑、骨、心肌、骨骼肌等组织中均未见eGFP细胞浸润。可见肝、皮肤、肠、肺、舌等组织第13天eGFP细胞多于第3天。而脾组织第13天eGFP细胞少于第3天(图3)。
GVHD表现及转归
A组小鼠移植后第8天开始出现GVHD表现,主要为消瘦、弓背、脱毛、乱毛、体重减轻和腹泻,最后全部在25天内死亡。出现GVHD表现小鼠的肝、肠符合急性GVHD的病理改变:肝组织显著水肿，细胞浊肿、变性,可见灶性坏死，汇管区淋巴细胞浸润；肠组织学表现黏膜脱落，腺体及绒毛水肿、坏死、糜烂，可见淋巴样圆形细胞浸润（图4）。单输骨髓细胞的B组小鼠无GVHD表现，肝、肠结构基本正常。A组、B组小鼠生存曲线比较表明，A组小鼠生存率明显小于B组小鼠(图5)(P<0.05)。
第3、7、13天，eGFP细胞比例，在肝细胞悬液中逐渐增多，从18.4±3.4%升高至70.8±5.3%；脾细胞悬液中逐渐减低，从60.7±8.3%降低至27.8±4.3%。肝、脾eGFP细胞中CD4T、CD8T淋巴细胞比例均逐渐升高（表2）。Table2.PercentagesofeGFPcellsinthecellsuspensionsandpercentagesofCD4,CD8cellsineGFPcells(略)
肝、肾及脾脏中MIP-1α的表达
与肾脏中MIP-1α水平相比，肝、脾中MIP-1α水平显著升高（P<0.05）;移植后第3天脾MIP-1α水平最高，为881.5±45.2pg/ml，肝中MIP-1α高峰水平出现在第7天，达491.3±32.1pg/ml(图6)。
讨论
本研究将C57BL/6鼠骨髓细胞与转eGFP基因的C57BL/6鼠脾细胞一起植入经8.0Gy照射的BALB/c鼠体内，成功建立了GVHD模型。eGFP可作为标记，用荧光显微镜或流式细胞仪可以直接检测供体T淋巴细胞在受体鼠体内的浸润、扩增情况。本实验系统可用于观察供体细胞的分布及动态变化，为GVHD的发生机理及防治研究提供了方法平台。目前认为，激活的CD4T淋巴细胞分泌免疫应答发生必需的细胞因子，激活CD8T淋巴细胞，使其成为细胞毒性T淋巴细胞，从而攻击受者细胞引发GVHD［1，2］。在本实验模型中，由于供者小鼠骨髓中T淋巴细胞含量极少，单纯输注供者骨髓细胞，虽然也能实现植入和供者型造血重建，但无GVHD发生。同时输注异基因脾细胞可使受者小鼠发生GVHD，在GVHD靶器官中出现受者T淋巴细胞的浸润和增殖。我们观察到受者脾与肝中eGFP细胞呈现不同的动态变化：肝中eGFP细胞逐渐增多，而脾中eGFP细胞逐渐减少。这一结果提示，供体T淋巴细胞在移植初期可能先进入脾等淋巴器官，在异基因抗原作用下，激活、扩增后，离开脾，进入肝、肠等GHVD靶器官。但不能排除肝、皮肤、肠等GHVD靶器官中存在供体T淋巴细胞的激活与扩增。例如最近有学者研究表明，供体T淋巴细胞可在肝、脾、肺中直接与抗原呈递细胞相互作用而激活、扩增［3］。经典GVHD靶器官主要是肝、肠和皮肤组织，GVHD的临床分级也主要根据这3个组织的损伤程度。临床资料表明，GVHD与移植后的许多并发症均有联系，如间质性肺炎、黏膜炎症或溃疡、出血性膀胱炎、味觉丧失等。有研究显示，脑、肾、牙龈、结缔组织、舌、鼻腔等组织中均可见供体淋巴细胞浸润，并将它们称之为非经典GVHD靶器官［4-6］。本研究采用荧光显微镜观测eGFP细胞的分布，在肝、肠、皮肤、肺、舌中发现eGFP细胞浸润，这提示除肝、肠和皮肤等传统GVHD靶器外，肺、舌也是潜在GVHD靶器官。我们在肾、脑、肌肉等组织中未观察到明显的eGFP细胞浸润，可能与肾、脑中供体淋巴细胞浸润较少或实验观测方法的敏感性有关。MIP-1α是一种重要的趋化因子，活化后的T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞和肥大细胞均可产生MIP-1α。T淋巴细胞有MIP-1α的受体CCR5、CCR7等的表达，MIP-1α对T淋巴细胞有趋化作用［7］。有研究表明，异基因造血干细胞移植的动物的肝、脾组织中MIP-1α,MIP-2和MIG水平升高；皮肤组织中可见MIP-1α,MIP-2,MCP-1和MCP-3水平升高［8，9］。本研究发现，GVHD模型中肝、脾组织的MIP-1α水平升高，表达高峰分别出现在第7天和第3天。国外有研究也显示，移植后第3天淋巴组织中趋化因子MIP-1α表达上调，在脾中MIP-1α由激活的T淋巴细胞产生。肝中MIP-1α表达晚于淋巴组织，由激活的T淋巴细胞产生，并与供者T淋巴细胞浸润一致，用MIP-1α单克隆抗体或输入MIP-1α-/-供体T淋巴细胞的方法,均可减少受体肝中CD8T淋巴细胞浸润，而且血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平和肝GVHD特异性病理表现均较轻［9-12］。这说明可能存在一个反馈机制，肝浸润T淋巴细胞产生MIP-1α，吸引CD8T细胞毒性T细胞进入肝脏。
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