成体小鼠肠神经嵴干细胞体外分离、培养及鉴定

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【摘要】

目的： 利用简化无血清培养基和连续传代法，从成体小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞(GNCSCs)，观察细胞体外培养过程中增殖、分化的特点. 用p75, GFAP,Peripherin,α?Actin作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系. 方法： 将新生1， 5 d的小鼠肠管制成单细胞悬液，接种于无血清DMEM/F12完全培养基中贴壁培养，连续传代培养并观察克隆球的形成过程. 将克隆球接种于含血清的DMEM/F12完全培养基中，观察其分化现象. 用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达. 结果： 成体小鼠肠管中有少数细胞在无血清培养基中存活且增殖形成克隆球. 免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清诱导下可分化为神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞. 结论： 成体肠管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs，在体外GNCSCs可分化为肠神经系统所必须的细胞类型.

【关键词】 肠神经嵴干细胞 小鼠 细胞培养技术 细胞分化 Hirschsprung病

0引言

应用神经干细胞治疗某些神经系统的损伤和退行性疾病，经过较长时间的实践已被证明是行之有效的［1］. 肠神经嵴干细胞（gut neural crest stem cells, GNCSCs）起源于神经管背侧，具有干细胞特性［2］，将其用于治疗先天性巨结肠症及肠神经系统干细胞疾病的研究已引起人们的关注,本实验着重进行GNCSCs的基础研究，为临床应用建立理论基础.

1材料和方法

1.1材料新生1，5 d昆明小白鼠，15只，体质量不拘，西安交通大学医学实验动物中心提供. ① DMEM/F12完全培养基（Gibco）组成：B27添加剂（Gibco），N2添加剂（Gibco），重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF, vitrogen), β?巯基乙醇（Sigma），青霉素和链霉素（华北制药）. ② 促分化培养基组成：DMEM/F12完全培养基除bFGF外再添加100 mL/L肽牛血清. ③ 其他：胰蛋白酶、Ⅳ胶原酶（Sigma），左旋多聚赖氨酸（Sigma）. 一抗：兔抗小鼠NGFRp75（武汉博士德）、兔抗Peripherin多克隆抗体(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗体（DAKO），鼠抗小鼠α?Actin单克隆抗体（Sigma）SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（博士得生物工程有限公司）. 二抗为TRITC标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉).

1.2方法

1.2.1取材、克隆球的培养颈椎脱臼法处死2组小鼠，将其肠管放入Hank?s，清洗，机械分散肠管组织，胰蛋白酶和Ⅳ胶原酶分别消化肠管组织30 min，10 min，终止消化后反复吹打制成单细胞悬液，用200目，400目的滤网过滤，以800 r/min 离心 5 min，弃上清，用预先配置的无血清完全培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数活细胞，以 6×108个/L接种到25 mL培养瓶中，添加培养基至4 mL. 在37 ℃, 50 mL/ L CO2,饱和湿度培养箱中水平放置，贴壁培养. 原代孵育24 h后弃去漂浮的死细胞，以2/3量换液，孵育3 d后进行传代，以6×108个/L接种到25 mL培养瓶中，继续孵育40~48 h后再次传代，如有细胞团块形成则以1代/1~2 d的速度传代，3代之后可形成圆形的克隆球.

1.2.2克隆球的分化用含100 mL/L胎牛血清的完全培养基重悬传代5次后的克隆球，接种于放置有预先包被左旋多聚赖氨酸盖玻片的35 mm培养皿内，每皿2 mL，动态观察克隆球的分化情况.

1.2.3克隆球及其分化细胞特异性标志物的染色应用p75NTR, GFAP, Peripherin，α?Actin抗体分别检测克隆球及其分化细胞系的性质，封片后分别用光学显微镜和激光共焦显微镜取图.

2结果

2.1克隆球的生长状况接种初期，倒置显微镜下观察到单细胞和一些呈半球状或不规则的细胞团. 孵育24 h后，贴壁细胞胞呈圆形，胞体小,折光性好，部分贴壁细胞胞体增大,折光性增强,出现分裂相，形成2～5个细胞的细胞团，另一部分呈聚集生长. 3 d后形成十几或数十个细胞构成的克隆球(图1A)，克隆球增大的同时向周围伸出放射状的细胞索，形成较小的次级克隆，这些克隆球形态完整，折光性减弱，周边界线清晰，但其中心密集，界限不清，无法观察到完整的细胞结构 （图1B）. 重新传代培养，可观察到细胞胞体增大，出现分裂相的克隆球数量逐渐增多，杂质细胞减少，在连续传代过程中克隆球逐渐纯化.

2.2克隆球的分化接种含血清培养基12 h后，可见有细胞从克隆球中迁出，迁出的细胞贴壁生长；24 h后克隆球变扁，迁移出的细胞增多，相差显微镜下难以分别形态；48 h后贴壁细胞数量明显增加，逐渐形成单细胞层且细胞形态多元化.

2.3克隆球及其分化细胞系的免疫染色免疫细胞化学方法进行p75, Peripherin, GFAP, α?Actin免疫染色（图1C,图2, 3）.

3讨论

许多研究表明GNCSCs在ENS的发生和发育起关键作用［3-4］. 目前HSCR的病因与RET等8种基因密切相关［4-5］，在RET等基因缺失模型中， GNCSCs的生存、增殖、迁徙及分化等功能发生障碍，受累肠道的相应神经节出现缺失，表明先天性巨结肠可能是一种干细胞疾病. 由于HSCR及肠神经系统干细胞性疾病在手术治疗后仍遗留有严重的并发症，因此用干细胞来进行临床治疗已成为研究的热点和重点. 鉴于胚胎干细胞的来源限制及免疫排斥问题，成体GNCSCs的研究将为今后的移植试验提供新契机.

GNCSCs的培养方法建立在中枢神经干细胞的基础上. 依据神经干细胞经典的培养方法，再结合GNCSCs“收获率”低、难以分离纯化的特点，联合应用简化的特殊培养剂和神经干细胞培养方法进行体外培养. 连续传10代后，GNCSCs的相对比例明显增加，这种体外培养的方法能有效地分离和纯化GNCSCs，但并不能完全消除其他细胞. 如果继续传代，其纯化程度越高，后续的试验效果将更佳. 连续传代不仅纯化了GNCSCs，还证实了干细胞的自我更新特性. 在体外培养干细胞时，培养条件稍有变化可导致分化机制的启动，因此采用血清促分化法诱导GNCSCs分化既简单又可靠. 通过免疫染色，证实了GNCSCs分化细胞的类型，同时显示了分化的亚型神经元及神经胶质细胞的形态，并表明了成体干细胞的多向分化能力.

【参考文献】

［1］ 杨帆,杨树源. 神经干细胞研究进展及临床应用前景［J］.医学综述, 2002；8(8):491-493.

［2］ Newgreen D, Young HM. Enteric Nervous System: development and developmental disturbances?part2［J］. Pediatr Dev Pathol,2002, 5(4): 329-349.

［3］ Natarajan D, Grigoriou M, Marcos?Gutierrez CV, et al. Multipotential progenitors of the mammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture［J］. Development 1999, 126(1):157-168.

［4］ Bondurand N, Natarajan D, Thapar N, et al. Neuron and glia generating progenitors of the mammalian enteric nervous system isolated from foetal and postnatal gut cultures［J］. Development 2003,130:6387-6400.

［5］ Gariepy CE. Genetic basis of Hirschsprung disease: implication in clinical practice［J］. Mol Genet Metab, 2003, 80(1?2):66-73.