关于猪HEV的探研

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我国是戊肝主要流行区之一。近几年来，在猪等与人关系密切的动物中陆续发现了hev感染。由于戊型肝炎产生的危害性，世界各国都非常关注。近年来许多国家都对戊肝进行了调查和研究，加强了对戊型肝炎的预防控制，同时对戊型肝炎的疫苗也进行了探索。随着不同地区HEV基因的成功克隆，全世界对戊型肝炎的研究取得了突破性的进展。

一、戊型肝炎病毒

1.病原学

HEV是一种无囊膜的球形颗粒病毒，形状为正二十面体。平均直径为32~34nm，表面呈尖刺和锯刺状，内部呈现两种不同形态：一种内致密，是完整的病毒颗粒，另一种内部透亮，是不含完整基因的病毒颗粒。蔗糖梯度离心，前者沉降系数为183S，后者为165S。浮力密度为130mg/cm3。对高盐、氯化铯及氯仿敏感。不易在4℃下保存，反复冻融及在蔗糖中可结成团，导致病毒活性下降。在碱性环境中较稳定，在镁和锰离子存在下可保持病毒完整。HEV对热稳定，当温度达到56℃时，50％的HEV会失活。当温度达到60℃时，几乎所有的HEV(96％)都会失活。

2.分子生物学

2.1基因组结构及编码

蛋白猪HEV是一个单股正链RNA，基因组全长约7.2 kb。包含5个非编码区、3个非编码区和3个相互重叠的阅读框0RF1、0RF2和0RF3。

ORFl位于28~5107核苷酸上。主要编码与NRA复制有关的非结构蛋白，pORFl氨基酸(aa)序列从N端到C端的功能分别为：病毒甲基转移酶、功能未知的Y结构域、木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶、富含脯氨酸的“铰链”结构域、功能未知的X结构域、RNA解旋酶和RNA依赖的NRA聚合酶。ORFl多聚蛋白的翻译和翻译后过程大多还不很清楚。ORFl对HEV的传染不是至关重要的，删除0RF1的变区不会减弱HEV的传染效率。

ORF2位于5147~7128核苷酸上。编码的氨基酸为660个，为主要的结构基因编码区。pORF2氨基酸序列具有典型的病毒衣壳蛋白特征，且带有明显的信号序列样区段并含有潜在的切割位点，其中翻译后修饰位点、蛋白酶水解位点1个以上，糖基化位点l~3个。

ORF3位于5106~5474核苷酸上。对ORF3编码蛋白的了解甚少，现已确定ORF3编码产物为磷蛋白，与细胞的支架及HEV型特异性免疫活性有关，至少有4个抗原表位，可能为型特异性抗原表位。ORF3蛋白包括反式作用元件因子，并编码一个对猕猴感染起作用的蛋白。有文献报道，ORF3蛋白对复制、病毒组装或体外肝瘤细胞的感染没有作用。但是ORF3编码的一个蛋白对体内的病毒感染力很重要。

研究发现，ORF2中与ORF3重叠的部分基因序列为ORF2中最保守部分。但该区所编码的蛋白质片段变异性最大。推测该部分基因序列可能折叠形成一较强的次级结构，从而抑制了核酸序列的变异。用于检测血清抗一HEV抗体及对HEV疫苗的研制多是围绕ORF2和ORF3而设计。

2.2基因型

猪HEV分为基因3型和基因4型。其和人HEV基因3型和4型的核苷酸序列具有很高的同源性，并在许多国家中发现。以前认为HEV基因1型是非动物传染病的，但最近在柬埔寨的猪粪便样品中发现。

在我国猪场中，HEV感染的情况非常严重。已经在中国的许多省份和地区发现。

随着猪HEV基因型研究的深入，发现基因型地域分布特征已经发生了重要改变。研究显示，同一个地区可以存在2种及2种以上的基因型，也发现同一种基因型可以在不同地域分布。

二、猪戊型肝炎病毒的传染途径

HEV在猪中被认为是通过粪-口途径传播的。被感染的猪排出的粪便含有大量的HEV，有可能是病毒传播的主要来源。据此认为，与被感染的猪直接接触或摄取被粪便污染的食物或水，猪会感染HEV。实验证明，通过口服接种猪HEV不易使猪感染上HEV。在研究猪HEV的传播途径的文章中指出，HEV通过静脉内注射和肝内注射方式能成功传染。由于被感染的猪的粪便含有大量HEV。因此猪粪会污染灌溉区或沿岸水，从而导致农产品或甲壳类动物的污染，而且在污水中已经检测到了猪HEV。

三、猪场中戊型肝炎病毒的存在情况

到目前为止，HEV只有一个血清型，自然感染HEV的猪是没有症状的。HEV通常感染2~4月龄的猪，被感染的猪有l~2周的病毒血症持续时间，而粪便中脱落病毒持续时间大概有3~7周。大多数成年猪包括母猪和野猪的HEV I如是呈阳性的，但是粪便中没有脱落病毒。

以前认为HEV只存在于不发达国家和发展中国家，其地域特征是卫生条件差，常和水源污染有关。但是随着美国株的分离，越来越多的HEV毒株从欧美发达国家被分离，人们越来越相信HEV呈全球性分布。

四、与猪接触的人群感染情况

HEV被认为是动物传染性疾病。家猪和野猪是HEV的储藏库。有学者对广西一猪HEV swGX40进行了全基因核酸序列分析，与HEV基因型4的核苷酸序列同源性为83.1~91.2％，扩增出来的HEV伽砣片段与人HEV株LZ-105和越南株HE-JVN-1的核苷酸序列同源性分别为94％和97％，结果表明HEV是可以相互传染的。

调查发现，与猪接触的职业人群的血清抗一HEV抗体高于非职业人群。有学者对基因4型进行分析，人通过与猪接触和猪的粪便接触可以感染HEV。说明从事与猪接触的职业人群存在一定的HEV感染的风险性。对2个人群戊型肝炎感染特征进行了比较，在340例接触猪的职业人群中，抗HEV－IgG阳性者254人，感染率74.71％；而在512例对照人群中，抗HEV－IgG阳性者319人，感染率62.30％。有学者对不同猪群和2个人群戊型肝炎感染特征进行了比较，成年猪的抗HEV阳性率为98.23％(222／226)；幼年猪的抗HEV阳性率为60.73％(99/164)；接触猪的职业人群抗HEV阳性率为42.5l％(105／247)；而在普通对照人群中，抗HEV阳性率仅为20.29％(522／2572)，与猪接触的职业人群的感染率明显比对照人群高。

五、猪戊型肝炎病毒的诊断

由于猪自身感染HEV无明显临床症状，判断猪是否感染HEV要通过实验手段来检验。猪HEV和人HEV在遗传学上没有太大差异。用于人HEV的诊断方法也可用于猪HEV的诊断。近几年已经建立了一系列常用的特异性诊断方法：

1.酶联免疫吸附实验(ELISA)

ELISA是目前用于检测血清HEV抗体最常用的一种方法，检测的血清抗体主要是IgG、IgM和lgA。其中以间接ELISA用途最广。

用于检测HEV的抗原有3种，即：组织培养全病毒抗原，合成肽抗原和表达抗原，目前最受关注的是表达抗原，常用的表达抗原有ORF2的表达抗原，ORF3的表达抗原以及同时含有0RF2和0RF3编码产物的重组表达抗原。

2.PCR方法

用于检测HEV最常用的是逆转录一巢式PCR(RT-巢式PCR)，这种方法可以较灵敏地检出含量减少的RNA基因组。由于戊肝病毒的基因型不同，因此用于PCR的引物设计非常关键。用RT-PCR方法检测时，血清阳转前l~2周可检测到HEV RNA。绝大多数样本血清阳转后测不出RNA，其在戊肝发病后血清和粪便中的病毒量均迅速降低，检出窗口较短，因此对采样时间有较高要求。已有很多学者利用SYBR Green和TaqMan探针来标记ORF2和ORF3基因的实时定量PCR来检测HEV RNA，而且用传统的巢式RT-PCR方法检测出来的阴性血清可以用实时定量PCR方法检测出HEV微粒。

3.免疫电镜(IEM)

免疫电镜法是最早用于检测HEV感染的手段，以实验感染动物的急性期、恢复期血清作已知抗体检查待测粪便、胆汁标本中的HEV颗粒，以观察到粪便标本中有由抗体包裹的3个以上病毒颗粒或经与抗体反应后的病毒凝集物至少3个以上则判断为阳性，如仅见1个或2个这样的病毒颗粒，应再次检查此标本，如仍有病毒颗粒或上述的凝集物存在则判断为阳性。该法的优点是直观可靠。但敏感性差，且特异性抗体来源有限和需用电镜。对仪器设备和检测人员素质要求较高，这就使其应用受到了较大的限制。

六、存在的问题及展望

迄今，由于没有一个成熟的HEV细胞培养系统，还不能用细胞培养方法大量培养HEV，因此，现阶段研制弱毒或灭活疫苗还不太现实。虽然猪HEV在猪中不是致病性的，但是还不清楚与猪HEV并发感染的其他病原体是否有协同效应，因此有必要研制疫苗来防止养猪业中猪HEV的感染。

目前猪是HEV的主要携带者，鉴于戊型肝炎人畜共患的问题，猪HEV能传染给人导致人引起肝炎，因此，预防猪HEV的感染能防止猪HEV传播给人类，特别是那些从事与猪相关的高风险职业人群。猪肉作为人类的重要食用肉制品和猪是人类器官移植的首选动物，因此对猪戊型肝炎病毒的诊断显得非常重要。对于猪HEV来说，不同的地区分离的病毒基因型和相关生物学特性都有很大的区别。虽然到目前为止HEV只有一个血清型，但是对于猪戊型肝炎的诊断还很不尽人意。很多文献采用人HEV重组蛋白作为诊断抗原的血清学诊断方法，从而导致诊断阳性数偏高，可能的原因是感染了相似的病原导致假阳性。

总之，虽然目前世界各国都对HEV进行了广泛的研究和探索，但仍有许多问题尚未解决，例如细胞培养方面需要寻找敏感细胞系并探索适当的培养条件；尚需寻求新的表达系统以用于研制戊型肝炎的疫苗；HEV种间的自然感染的传播机制等。因此需要研究开发用于流行病学调查和临床标本检测的，更为敏感、特异、廉价的诊断试剂盒，建立猪源性HEV的跨种间感染与传播的动物模型等。随着分子生物学的发展，猪HEV基因疫苗的研制和开发必将出现新的突破，猪戊型肝炎也会在不久的将来得到有效的控制。

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