兔缺血心肌中移植自体骨髓基质干细胞的治疗作用
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Autologous marrow stromal cell transplantation for improving rabbit cardiac performance after myocardial infarction
【Abstract】 AIM: To test the hypothesis that marrow stromal cells (MSCs), when implanted into selfmyocardium, can undergo milieudependent differentiation, express cardiomyogenic phenotypes and enhance angiogenesis and cardiac function of ischemic hearts in vivo. METHODS: Acute myocardial infarction was induced by occlusion of left anterior descending artery, and autologous MSCs labeled with BrdU (Bromodeoxyuridine) in vitro were administrated intramyocardially into the infarct area of the same donor rabbits. RESULTS: After 4 weeks, transplanted MSCs demonstrated myogenic differentiation with the expression of αsarcomeric actin and connexin 43. MSCs displayed increased levels of VEGF protein ［(684±86) fg/L vs (515±51) fg/L, P<0.05］ and the number of vessels ［(22.9±6.6)/HP vs (19.0±5.9)/HP, P<0.05］ in myocardial ischemia area, compared with those in controls. MSCs implantation resulted in markedly improved left ventricular contractility ［LVSP: (15.08±0.84) kPa vs (13.26±0.68) kPa; LVEDP: (1.53±0.28) kPa vs (19.03±0.41) kPa; +dp/dtmax: (+615.77±48.69) kPa/s vs (+435.75±58.25) kPa/s; -dp/dtmax: (-401.17±46.23) kPa/s vs (-338.25±50.72) kPa/s, P<0.05］. CONCLUSION: Autologous MSCs transplantation can effectively treat myocardial ischemia without immune rejection.
【Keywords】 marrow stromal cell； ischemic myocardium； transplantation
【摘要】 目的：验证骨髓基质干细胞（MSC）移植到缺血心肌中后是否在心肌的微环境中可以向心肌细胞分化，提高心功能. 方法：采用自体MSC体外培养扩增移植. 在通过结扎冠状动脉造成急性心肌缺血后，被5溴2脱氧尿苷（BrdU）标记后的MSC移植到自体的缺血心肌中. 结果：移植4 wk后，MSC向肌细胞分化，表达出α横纹肌肌动蛋白（sarcomeric actin）和存在于闰盘中的connexin 43，移植后心肌表达VEGF增加［(684±86) fg/L vs (515±51） fg/L，P<0.05］，缺血心肌局部血管密度增加［(22.9±6.6)/HP vs (19.0±5.9)/HP，P<0.05］，左室收缩功能明显强于对照组［LVSP: （15.08±0.84）kPa vs （13.26±0.68） kPa; LVEDP: （1.53±0.28）kPa vs（ 19.03±0.41） kPa; +dp/dtmax: （+615.77±48.69）kPa/s vs （+435.75±58.25）kPa/s; -dp/dtmax: （-401.17±46.23） kPa/s vs （-338.25±50.72） kPa/s, P<0.05］. 结论：MSC移植可治疗心肌缺血，并且没有免疫排斥反应.
0引言
在离体实验中发现骨髓基质干细胞（marrow stromal cells，MSC）可以被5杂氮胞苷诱导为心肌细胞［1］. 由于自体MSC容易被获取，而且具有较强的增殖能力，自体MSC应用于临床可以不再需要胚胎组织和应用免疫抑制剂，因此较其他来源的供体细胞更有优势. 为了同未来的临床实践相吻合，我们应用自体MSC移植入缺血心肌中，而没有用被诱导后的MSC. 目的是着重探讨移植后MSC特异性蛋白的变化及其对与心功能的影响.
1材料和方法
1.1材料
取健康雄性的新西兰兔(2.5~3.5) kg（浙江大学医学院动物实验中心），经耳缘iv戊巴比妥纳（30 mg/kg）麻醉，用骨髓穿刺针无菌抽取骨髓，Percoll细胞分离液分离细胞，接种于培养瓶中，培养液用含200 mL/L胎牛血清的完全LDMEM（2 mmol/L L谷氨酰胺，1×104 U/L青霉素和25 μg/L两性霉素），37℃，50 mL/L CO2孵箱静置培养. 抽取的每个动物的骨髓基质干细胞及每个动物均进行编号. 取传第2代的MSC于移植前24 h用BrdU(5溴2脱氧尿苷, Sigma)标记骨髓基质干细胞，10 μL BrdU贮液(BrdU, 50 mg; 二甲基亚砜0.8 mL; 三蒸水1.2 mL)加入5 mL完全培养液中. 移植前用PBS调整细胞密度为1×1011/L. 标记细胞的检测（免疫组化）：先加2 mol/L盐酸（室温，50 min），正常山羊血清封闭10 min，不洗，甩掉，加含3 g/L Triton X100的1∶40鼠抗Brdu mAb（抗体稀释液稀释），加入生物素标记的羊抗鼠抗体（室温80 min），加入SABC复合物室温50 min，DAB显色，脱水、透明、封片.
1.2方法
30 g/L的戊巴比妥钠（30 mg/kg）经耳缘iv麻醉. 心电图导联线与兔四肢相连接入八道生理记录仪之心电图放大器（AC601G）记录标准Ⅱ导联心电图. 在胸骨左缘胸肋关节处剪断Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ肋骨开胸，剪开心包膜，用小拉钩将心包膜固定于胸壁，充分暴露心脏. 用眼科小圆针在冠状动脉左室支主干中上1/3处结扎，心电图Ⅱ导联上出现ST段弓背样抬高为结扎成功. 生存的13动物被随机分为2组，实验组（M组，n1=7）于心肌梗死前后缘上、中、下各3点分别注射自体MSC 1×1011/L，对照组（C组，n2=6）注射同等数量的PBS. 4 wk后重返实验室，麻醉方法同前. 先行心脏彩超检查，测量左室后壁运动幅度、左室收缩期室壁增厚率及射血分数，而后分离颈动脉行左心室插管，左心室插管经三通接八道生理记录仪之载波放大器，记录左心室压力曲线，左心室压力微分曲线，记录左心室舒张末压（LVEDP）、左心室收缩压（LVSP）左心室压力微分（dp/dt）： 曲线及左室压正负变化最大速率（±dp/dtmax）.
1.2.1移植MSC向心肌细胞分化的检测测量完毕后，取心肌梗死区的组织进行冰冻切片，行免疫荧光双标法染色确定移植骨髓基质干细胞向心肌细胞分化. 免疫荧光双标法：切片加2 mol/L HCl中30 min（37℃）， 0.01 mol/L硼酸液中和10 min，浸入含0.3 g/L Triton X100的0.01 mol/L KPBS 30 min后，首先入1∶100小鼠抗兔аsarcomeric actin抗体4℃孵育24 h后，0.01 mol/L KPBS漂洗，然后入1∶100的FITC标记的antiBrdU抗体及1∶100的Cy3标记的羊抗小鼠IgG (1∶200的TRITC标记的羊抗小鼠IgG)，避光孵育4 h，漂洗后缓冲甘油封片，激光共聚焦显微镜观察.
1.2.2Western blot分析取心肌梗死区的组织，在-80℃和37℃之间反复冻融6次，移入1.5 mL Ep管中，4℃，14 800 g离心15 min，取上清. 用100 g/L的SDSPAGE胶分离蛋白质，Bradford法蛋白定量后，均取20 μg总蛋白行120 g/L SDSPAGE凝胶电泳，电转移于NC膜上，加入一抗VEGF (1∶1000, Chemicon), bFGF (1∶1000, Santa Cruz)，4℃过夜. PBST洗膜15 min×1. 将膜装入塑料袋中，加入用PBST稀释羊抗小鼠IgG（1∶1000）， 37℃ 1 h. PBST洗膜15 min×3. 放射自显影：按照ECL试剂盒(Amersham公司)说明进行，观察照相.
1.2.3ELISA法测定局部心肌组织中VEGF的表达将局部心肌组织匀浆后以24 800 g离心.用ELISA试剂盒(Santa Cruz)检测心肌组织中VEGF的表达.
1.2.4梗死区血管数目的检测切片经过免疫组化染色血管标志物凝血Ⅷ因子. 采用SABC免疫组化法染色（武汉博士德），组织切片加入小鼠抗Ⅷ因子mAb (Dako)在4℃过夜，加入生物素标记的羊抗小鼠IgG 37℃孵育1 h，再滴加SABC，37℃孵育1 h，最后用DAB显色，苏木素复染. 经过免疫组化染色的微血管呈棕黄色，为了量化缺血区的血管数量，每只动物取10张切片，每张切片随机取3个200×视野，进行血管记数. 凡是免疫组化凝血Ⅷ因子染色成棕黄的2个或2个以上内皮细胞簇均作为1个血管记数.
统计学处理：所有资料用x±s表示，由SPSS 10.0软件包处理. 两组间比较采用t检验，不同时间点超声观察指标的比较采用重复测量资料的方差分析，P<0.05为有统计学意义.
2结果
在原代培养的MSC中，多数为成纤维样的梭形细胞，偶有宽阔、平坦的多边形细胞，初始细胞呈团簇生长，向四周发散. 经换液培养后，造血细胞基本消失，贴壁细胞体积较大，均为一致的梭形细胞. 随着时间的延长，细胞形成克隆样生长，渐渐铺满整个培养瓶. 传代后生长的细胞形态一致，均为成纤维样的梭形细胞，有时可见细胞融合（图1A）. 我们用BrdU标记准备移植的MSC. BrdU在细胞生长的S期标记细胞核，可见BrdU阳性的细胞核呈现棕黄色，还可见到核分裂像（图1B）. 移植的MSC经过免疫荧光双标法显示BrdU及αsarcomeric actin(connexin 43)
通过Western blot检测分析显示移植MSC的心肌组织中VEGF和bFGF表达较对照组高（图4），ELISA分析显示移植MSC可促进心肌组织中VEGF表达［(684±86) fg/L vs (515±51) fg/L，P<0.05］. 凝血Ⅷ因子存在于血管壁，介导凝血反应，是血管内皮细胞的标记物，通过免疫组化可显示微血管内皮细胞呈现棕黄色（图5）. 实验组血管数量明显高于对照组［(22.9±6.6)/HP vs (19.0±5.9)/HP，P<0.05］.
从超声心动图上显示左室侧壁运动幅度（LVFWSD，mm）、左室收缩期室壁增厚率(LVΔT，%)及左室射血分数(LVEF，%)在术前和移植前均没有明显差异. 移植后4 wk后，实验组（M组）和对照组（C组）有明显差异. 左室侧壁运动幅度:（1.75±0.42）mm vs （1.09±0.28）mm; 左室收缩期室壁增厚率: （18.5±4.8）% vs （10.8±3.6）%;
3讨论
兔可提供充足数量的MSC以供移植所需［2］. 心肌中的微环境可以支持被移植的MSC的生长，并且可以促进MSC向心肌细胞分化［3-4］. 我们发现被BrdU标记的MSC移植到心梗区后表达出α横纹肌肌动蛋白，同时表达出存在于闰盘中的connexin 43，说明分化为心肌细胞的MSC同周围心肌细胞通过闰盘连接，同周围宿主细胞形成功能合胞体. MSC的这种“归巢”和表达不同组织特异性基因的能力说明组织微环境对于MSC 的分化起了重要作用. 我们发现，移植MSC后衡量左室收缩功能的指标(LVEF, LVSP，dp/dtmax，左室后壁运动幅度和左室收缩期室壁增厚率)较对照组高，左室舒张功能指标（LVEDP和dp/dtmin）较对照组恢复好. 移植MSC后，心肌缺血组织表达bFGF和VEGF增加，而且血管数目较对照组增多. 这种不同于以前报道的同种基因大鼠之间进行的细胞移植模型［5］，更接近于临床，意义更大.
【参考文献】
［1］ Hakuno D, Fukuda K, Makino S, et al. Bone marrowderived regenerated cardiomyocytes(CMG Cells) express function adrenergic and muscarinic receptors［J］. Circulation, 2002,105(3):380-386.
［2］ Abbott JD, Giordano FJ. Stem cells and cardiovascular disease［J］. J Nucl Cardiol, 2003,10(4):403-412.
［3］ 张勇，蔡振杰，陈如坤. 小鼠骨髓基质干细胞定向诱导为前体心肌细胞［J］. 第四军医大学学报，2004,25(17)：1570-1574.
［4］ 吴铁军，蔡振杰，俞世强，等. 不同浓度5杂氮胞苷对骨髓间质干细胞体外诱导分化的作用［J］. 第四军医大学学报，2003,24(15)：1373-1375.
［5］ Saito T, Kuang JQ, Lin CC, et al.Transcoronary implantation of bone marrow stromal cells ameliorates cardiac function after myocardial infarction［J］. J Thorac Cardiovasc Surg, 2003,126(1):114-123.