地黄植株体内miRNAs与其连作障碍关系的研究进展
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[摘要]MicroRNAs是一类内源性小分子的非编码RNA，它通过对其靶基因的降解或抑制翻译来调控基因表达，进而调控植物的生理活动。植物在遇到逆境胁迫时，miRNAs会作用于与逆境相关的基因，启动体内的抗逆机制抵抗不利因素。地黄的连作障碍也是一种胁迫，从miRNAs水平上研究，有利于解读地黄连作障碍的分子机制。该文对地黄体内miRNAs的功能及调控机制进行了综述，并对miRNAs在地黄的研究中进行了展望。
[关键词]地黄； miRNAs； 连作障碍； 胁迫； 基因调控
[Abstract]The efficacy of Rehmannia glutinosa which as a large quantity of traditional Chinese medicine is significant. However， the land must be given up after one season of R. glutinosa cultivation or replanted after a period of 810 years because of the severe continuous cropping obstacles. MicroRNAs is a class of endogenous noncoding small RNAs， which participate in regulation of physiological activities by target mRNA cleavage or translational repression in plants. In recent years，studies on the role of miRNAs in plants have made significant progresses，especially in medicinal plants.MiRNAs from some different medicinal plant species have been identified with regulatory effects.When plants are exposed to environmental stress， miRNAs act on stressrelated genes and initiate stressresistance mechanisms in the body against adverse factors. R. glutinosa is also a kind of environmental stress. It is conducive to deciphering the molecular mechanism of continuous cropping obstacles for us by researching miRNAs. This article reviews the production of miRNAs， mechanism， research approaches and characteristics of resisting the environmental stresses in plants， the development trends and future prospect of R. glutinosa miRNAs research.
[Key words]Rehmannia glutinosa； microRNA； continuous cropping obstacles； stress； gene regulation
MicroRNAs（miRNAs）作檎婧松物细胞内基因表达的重要调控因子，越来越备受关注[1]。miRNAs是一类内源的、长度约 21～24 nt的非编码小RNA（Small RNA）分子，它最早在线虫Caenorhabditis elegans L中被发现，之后在拟南芥、玉米、小麦、水稻等植物中，通过高通量测序、生物信息学预测、基因克隆等方法鉴定了不同类型和不同数量的miRNAs家族[2]。随着miRNAs研究的不断深入，通过对拟南芥、水稻等模式植物miRNAs 功能的研究揭示了miRNAs 在植物的生长、发育、逆境胁迫等生理过程中发挥着重要作用[3]。最近的研究表明：植物在不同的逆境胁迫下诱导特异miRNAs 的表达，并证实了某些miRNAs 在植物遭受逆境胁迫时而做出适应性调整的过程中起着重要的调控作用[4]。
地黄Rehmannia glutinosa L属玄参科多年生草本植物，以块根入药，是我国著名的“四大怀药”之一。但在地黄种植过程中，连作障碍已成为制约地黄规模化生产的重要因素之一。重茬地黄表现为植株生长不良、地下部多形成须根，块根不能正常膨大，产量和品质明显下降，甚至绝收。大量的研究正在试图解密连作障碍形成的生物学机制[56]。地黄的连作障碍其实是一种逆境胁迫现象，随着地黄连作障碍分子机制研究的深入，从miRNAs的调控机制入手，揭示连作障碍的形成过程，已取得初步进展，其结果表明：重茬地黄体内存在着特异的mirnas响应，即miRNAs参与了地黄连作障碍的分子调控[79]。本文对前期报道的地黄体内miRNAs的发掘及其功能解析、miRNAs在地黄连作障碍形成中的调控机制等方面进行综述，为深化地黄连作障碍形成的分子机制研究提供参考。
1地黄体内miRNAs的发掘及其功能解析
11植物miRNAs的形成机制植物miRNAs 是由分布于整个基因组中独立的 MIR 基因编码产生的，MIR基因由 RNA聚合酶 Ⅱ（PolⅡ）转录产生一个或多个较长的初级转录产物（PrimiRNAs）；PrimiRNAs结构由miRNAs，miRNAs互补片段和中间间隔区组成，长度为60～300 nt，进一步形成一个特定的二级茎环的发夹结构；具发夹结构的PrimiRNAs被DCL1（Dicerlike 1）切割为前体 miRNAs（PremiRNAs），形成双链 miRNAs（miRNAs：miRNAs）复合物；再在HYL1 （Hyponastic leaves 1）、HEN1（Hua enhancer 1）、HST（Hasty）等蛋白的协助下从细胞核转运到细胞质中，解旋后与AGO（Argonaute）蛋白作用形成一个RNA诱导沉默复合物（RNAinduced silencing complex，RISC），产生的单链成熟miRNAs保留在RISC复合体中，并结合到与其互补的靶mRNA位点，在转录后水平上介导靶mRNA的降解或翻译抑制来实现基因表达的负向调控[1011]。
12地黄miRNAs的鉴定根据miRNAs产生的特点，miRNAs的鉴定首先是通过对细胞sRNA直接克隆并测序而获得的。之后，利用生物信息学方法（包括比较基因组预测、同源搜索、利用前体物序列的二级结构特征分析等）预测了许多物种基因组、转录组或EST序列数据库中存在的miRNAs[1214]。近年来，利用高通量测序技术已从65种植物中鉴定了7 827个miRNAs家族（miRBase 210 数据库）。2011年，Yang等[7，9]利用高通量测序技术构建了头茬和重茬地黄sRNAs文库，利用生物信息学技术首次从地黄中鉴定了25个保守的miRNAs家族。根据miRNAs前体物二级结构特征，以NCBI数据库中仅有的1 536条地黄EST序列作为参考序列，利用RNAfold软件和RTPCR方法，从地黄中克隆并鉴定了6个新型miRNAs （属于6个miRNAs家族）。miRNAs在生物体内广泛存在，其数量约为编码基因总量的1%[15]。前期研究以EST数据库为参考所鉴定的地黄miRNAs种类和数量非常有限，为进一步发掘地黄体内的miRNAs，Yang等[7，9]和Li等[8]先后重新构建了不同年份的头茬和重茬地黄sRNAs文库，利用生物信息学技术共鉴定598个保守的miRNAs家族。基于地黄转录组数据库，利用生物信息学和克隆技术鉴定新型的miRNAs。地黄体内miRNAs的鉴定为探索地黄连作障碍的分子调控机制提供了重要的基础数据。
13地黄miRNAs靶基因预测、鉴定及其功能由于植物miRNAs 与其剪切的靶基因位点几乎完全互补配对，根据这一特征可准确预测miRNAs潜在的靶基因。前期许多研究利用植物psRNATarget，miRU，Targetfind，Targetalign 等预测miRNAs的靶基因被发现并得以证实[1617]。在地黄功能研究中，Yang等[7]首先利用psRNATarget软件对29个miRNAs靶基因进行预测，获得了372个靶基因，其功能分析表明，它们可能具有转录因子、金属离子结合、核甘酸结合、蛋白修饰等分子功能，参与了转录调控、新陈代谢、逆境生理等多种的生理活动过程。伴随高通量测序的发展，German等[1819]首次运用降解组测序技术（degradome sequencing）检测了miRNA剪切的靶基因，该方法结合了高通量测序技术、生物信息学分析和RACE验证三者优势，已成功应用于许多植物miRNAs靶基因的鉴定。2013年，Li等[8]利用降解组测序技术，分别构建了头茬与重茬地黄降解组文库，鉴定了85个miRNAs家族165个靶基因，其靶基因功能分析表明：miRNAs可能参与了地黄的生长发育、信号传导、营养物质的运输、花器官的形成和逆境胁迫响应等多种生物学过程。
2miRNAs在地黄植株体内连作障碍形成中的调控机制
为寻找重茬地黄体内特响应的miRNAs，Yang等[7，9]利用高通量测序技术构建了头茬和重茬地黄miRNAs差异表达谱，初步筛选了32个响应连作障碍的miRNAs家族，之后，杨艳会[7，9]和Li等[8]先后重新构建了不同年份的头茬和重茬地黄miRNAs差异表达谱，并结合前期研究的miRNAs差异表达谱，最终筛选了303个差异表达miRNAs家族。由于miRNAs负向调控着靶基因的表达，为锁定响应连作关键的miRNAs家族，利用前期报道的头茬与重茬地黄根及其叶差异基因表达谱，追踪了连作障碍异表达85个miRNAs家族的靶基因，其结果表明：重茬地黄特异响应的46个miRNAs表达模式与其关键的靶基因表达模式可能存在着一致的负向调控关系[7，2021]。由此认为，重茬地黄体内自毒物质可能响应了特异miRNAs，改变了基因表达的程序，致使其体内一系列生命活动系统的紊乱而导致连作障碍，现将miRNAs在重茬地黄体内参与的主要生物学过程总结如下。
21miRNAs参与重茬地黄体内自毒物质响应的信号转导途径地黄miR1851家族靶基因之一是植物促分裂原活化蛋白激酶MAPK（mitogenactivated protein kinase），它是一类存在于真核生物体内的丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶，它与MAPKK（mitogenactivated protein kinase kinase）和MAPKKK（mitogenactivated protein kinase kinase kinase）共同组成MAPK级联信号通路，在生物体内基因的快速转录、离子通道的活性调节、细胞骨架结构的重新定位以及第二信使的产生等核心生命过程中发挥重要作用[2224]。在重茬地黄体内，miR1851过量表达，降解靶基因MAPK的碱基片段，抑制了重茬地黄体内MAPK级联的下游信号传递，干扰了地黄体内多种生理活动。地黄miR4414家族鉴定的一个靶基因编码钙离子逆向运输交换器（Ca2+ antiporter/cation exchanger），该蛋白负向调控着植物细胞内钙离子的浓度[25]。钙离子是植物逆境胁迫响应的重要信号系统，而细胞内钙离子浓度的增加是植物胁迫响应的一个主要标志[26]。在重茬地黄体内根际化感自毒物质的积累及其效应可能是造成连作胁迫的主要因素[27]。在重茬地黄体内，自毒物质被细胞内钙信号系统感知[21]和传导，引起miR4414的过量表达，可能抑制了钙离子逆向运输交换器基因的表达，阻碍了钙离子逆向运输途径，加强了重茬地黄体内钙信号的传导系统，使细胞内钙离子浓度过高。由于胞内游离钙水平的升高是植物体产生乙烯的一个启动信号，可促进乙烯的合成[28]。而且，地黄miR830家族的一个靶基因编码乙烯响应蛋白（ethyleneresponsive protein，ERP），在重茬地黄体内下调的miR830，可能激活了EPR基因的表达，Yang等[22]研究发现ERP基因在重茬地黄体内确实存在着下调表达。由此认为，重茬地黄体内自毒物质的信号转导系统的加强，可以促进乙烯的合成，加速地黄衰老的进程。
22miRNAs参与重茬地黄体内的营养运输途径地黄miR1508家族的一个靶基因编码氮转运蛋白（nitrogen transporter NRT12），该蛋白位于细胞质膜，主要在氮离子从胞外向胞内转运过程中发挥重要作用。在重茬地黄体内miR1508家族上调表达，抑制了NRT12基因的正常表达，可能干扰了胞内氮离子的输入，抑制或减弱植物体内氮营养的吸收。而且地黄miR1861 和miR4356家族靶基因中均有一个编码钾转运蛋白（potassium transporter）基因，它是钾转运蛋白家族的成员，在植物内具有钾离子跨膜转运蛋白活性[2930]。在烟草根部可促进K+吸收及其根部向地上部的运输，该基因的正常表达能增强植物细胞抗逆性[3132]。重茬地黄体内miR1861和 miR4356家族的过量表达，抑制了PT7的活性，减弱了胞外钾离子的跨膜运输。以上这3个miRNAs家族在重茬地黄体内特异响应，扰乱了地黄体内氮和钾离子的正常运输，引起地黄体内营养元素的缺乏，植株发育不良，降低了重茬地黄的抗逆性。
23miRNAs参与重茬地黄细胞内的核心代谢过程miR7811家族一个靶基因编码染色体结构维持（structural maintenance of chromosomes，SMC）蛋白，该蛋白主要参与有丝分裂染色体的集缩和分离、遗传重组和DNA修复等过程[33]。重茬地黄体内miR7811的过量表达，降低了SMC基因的正常表达，可能会影响到染色体的有丝分裂及DNA修复等过程，使得细胞内的遗传信息发生改变。miR163家族鉴定的一个靶基因编码RNA指导的RNA聚合酶（RNAdirected RNA polymerase），是RNA转录过程中的关键酶，在RNA合成中起重要作用[3435]。Yang等[22]报道证实了RNA指导的RNA聚合酶基因在地黄连作障碍发生过程中的表达被抑制，尤其是块根膨大前期，该基因几乎不表达。在重茬地黄体内，响应连作的miR163过量表达，降解了与其互补的靶基因（RNA指导的RNA聚合酶）碱基片段，抑制了RNA指导的RNA聚合酶基因的表达，干扰了重茬地黄体内的RNA合成过程。miR531家族靶向的一个基因编码60S 核糖体蛋白（60S ribosomal protein，RP60S），该蛋白参与mRNA翻译蛋白的调控[3637]。miR531在重茬地黄体内过量表达，抑制了60S 核糖体基因的表达，miR531间接地抑制了植株体内蛋白的合成。以上这3个miRNA家族由自毒物质诱导而过量表达，可能使得地黄体内DNA复制、RNA及蛋白合成的核心代谢途径被阻扰，扰乱了植株体内正常的代谢途径。
24miRNAs参与重茬地黄须根的生成地黄miR160家族调控的靶基因是生长素响应因子（auxin response factor，ARF）ARF10和ARF16，它调节着植物根冠细胞分裂和分化的平衡[3839]。在miR160过量表达的转基因拟南芥中，ARF10 和ARF16 蛋白的缺失或减少使得根冠细胞分化受阻，分裂失控，形成类似于肿瘤的结构，并导致根尖干细胞群的异位扩大[38]。在重茬地黄体内miR160出现特异过量表达，miR160通过转录本特异剪切控制ARF10和ARF16的表达被抑制或关闭，可能使其根部细胞分化受到阻扰，抑制地黄根部发育，导致块根不能正常膨大。地黄miR165家族的靶基因编码HDZipⅢ 蛋白，该蛋白家族可能在植物顶端分生及侧生分生组织的形成、侧生器官极性建立等过程中扮演重要角色[40]。在拟南芥中，下调表达miR165启动了HDZip Ⅲ基因过量表达，促进植物根部分生组织的木质部形成，产生较多侧根[41]。在重茬地黄体内miR165家族下调表达，可能激活了HDZip Ⅲ 基因过量表达，促进植物根系侧根的发生，即形成较多的须根，抑制了块根膨大。地黄miR408家族靶基因编码一个LBD（lateral organ boundaies domain）蛋白，该蛋白在植物侧生组织的发育中起重要作用[4243]。在玉米中，LBD基因的过量表达促进了根系侧根的形成[44]。重茬地黄体内miR408家族表达被抑制，激活了LBD基因的表达，诱导地黄根系须（侧）根的形成，产生了较多的须根，抑制了地黄块根的膨大。
25miRNAs参与重茬地黄植株开花及花器官的形成miR156/miR157家族靶基因是SPL（squamosa promoter binding proteinlike）家族基因，SPL可在转录水平直接激活开花基因AP1（APETALA1），FUL（FRUITFULL），SOC1（suppressor of overexpression of constans 1）的表达而诱导植物开花[4546]。在拟南芥中，miR156/157过量表达抑制SPL结构域基因表达量下降，延长植物营养生长时期而推迟开花[4647]。在重茬地黄体内，从块根膨大前期到成熟期，miR156/157表达量与头茬地黄相比，其表达量显著下降，尤其在地黄块根膨大前期，其表达量差异最显著[79，48]。重茬地黄体内miR156/157的下调表达，可能启动了SPL基因过量表达。Yang等[2021]前期研究发现，在连作障碍特异响应的基因中，SPL基因在重茬地黄体内上调表达，尤其是块根伸长期，其表达量最高。由此表明：重茬地黄体内的miR156/157家族表达被抑制，促进了靶基因（SPL）过量表达，诱导地黄提前开花，缩短了植株的营养生长期，致使重茬地黄的营养器官块根（发育）不良，加速植株早衰。而且，地黄miR167家族调控的靶基因是ARF家族中的ARF6，ARF8，它们参与调控植物花器和果实等生殖生长过程[49]。在拟南芥中，ARF6，ARF8过量表达促进花器官的发育[50]。在重茬地黄体内，miR167家族的表达被抑制，诱导了ARF6，ARF8基因的过量表达，可能促进了地黄花器官的发育，抑制了地黄根部发育，加速植株衰老。
3展望
地S连作障碍特异表达miRNAs的发现与功能解析表明，重茬地黄体内自毒物质信号的诱导，很有可能响应了特异miRNAs的表达，改写了基因正常表达程序，阻碍了核心代谢途径，使植株全方位受害，引起了地黄的连作障碍。前期的研究为全面揭示地黄连作胁迫下miRNAs及其靶基因表达调控的本质提供强有力工具。深入研究miRNAs 的功能以及利用RNAi 干扰技术抑制关键miRNAs 的表达，并且根据关键miRNAs的分子调控机制，结合分子育种技术，以后可能选育出对化感物质不敏感的新品种，以及提高地黄的产量和质量，这对中药产业的可持续发展具有重要的经济价值。前期报道的地黄miRNAs是以mRNA转录本为基础数据、主要存在于基因区域的miRNAs；由于地黄基因组序列未知，而基因间隔区和内含子区的miRNAs还未被发掘，这将意味着地黄体内仍存在着许多未知的响应连作障碍关键的miRNA家族正亟待我们发现。而且，另几类新型的非编码RNAs（lncRNAs，tasiRNAs，natsiRNAs）的发现和功能解析，也是现代生命科学的研究热点，这将会丰富对地黄响应连作障碍的基因表达调控机制的认识，从多个角度更加深刻地理解地黄连作障碍分子调控的机制。
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