WT1基因在急性髓系白血病中的作用研究

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摘要：目的：量化研究wt1基因在急性髓系白血病中的作用。方法：用实时定量RT-PCR方法检测急性髓系白血病患者化疗前后骨髓单个核细胞WT1 mRNA表达量。结果：40例急性髓系白血病患者中，33例化疗前WT1 mRNA值增高，阳性率为82.5%，化疗后完全缓解者27例WT1 mRNA 值转阴或明显下降，部分缓解者WT1 mRNA值下降，无效者WT1 mRNA值变化不明显。长期持续缓解者，WT1 mRNA值阴性或稳定在较低水平，复发患者1~2月前WT1 mRNA再次升高。结论：WT1 mRNA表达量的测定对急性髓系白血病微小残留病检测具有重要意义。可以作为急性髓系白血病疗效评估和监测急性髓系白血病微小残留的指标。

关键词：急性髓系白血病；WT1基因； 逆转录聚合酶链反应；微小残留病

【中图分类号】R557【文献标识码】A【文章编号】1672-3783(2012)03-0025-02

WT1基因，也就是Wilms肿瘤基因，最早在儿童遗传性肾母细胞瘤瘤细胞的11号染色体短臂1区3带中检测出来。近年来，在各种类型白血病包括急性和慢性白血病都检测出WT1基因高表达。为进一步了解WT1基因与急性髓系白血病的关系，我们采用了实时定量-PCR方法在化疗前、后检测40例WT1mRNA基因量的变化。

1 对象

选取2009年1月至2011年6月在我院就诊患者，其中40例急性髓系白血病，男28例，女12例，中位年龄39岁。按MICM分型M02例，M15例，M214例，M310例，M43例，M54例，M62例。另外选取5例缺铁性贫血及5例正常人。治疗方法按标准急性髓系白血病化疗方案诊治。

2 方法

2.1 细胞采集与RNA提取：取骨髓涂片同时取肝素抗凝骨髓1ml，用PH7.2~7.4磷酸盐缓冲液稀释后，用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用PH7.2~7.4磷酸盐缓冲液反复洗涤细胞后，用TrizolRNA提取液裂解后-80℃保存至RNA提取。

2.2 PCR引物由中国科学院上海细胞生物研究所协作提供。

WT1引物（外引物）序列为:

上游引物：5′-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3′，

下游引物：5′-GAGAGTCAGACTTGAAAGCAGT-3′；

β-actin引物（内引物）序列为:

上游引物：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，

下游引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。

2.3WT1的对照组以慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞为WT1阳性对照，以无模板PCR产物为阴性对照，以β-actin为内部标准。参照Inoue和Tamaki的方法，取4.0μg总RNA进行逆转录反应，反应体系为30μl。取5μl cDNA进行WT1和β-actin的PCR扩增，体系为100μl。WT1和β-actin的PCR条件为：变性，94℃，1分钟；退火，WT1 63℃，β-actin 60℃，1分钟；延伸，72℃，1.5分钟，扩增WT1 30个循环，产物为481bp，扩增β-actin 20个循环，产物为540bp。K562细胞cDNA经一系列稀释后的RT-PCR证实，该条件下WT1的检测敏感度为10-4以上。PCR扩增后，取10μl PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳(150V，60分钟)，然后用GDS 8 000凝胶成像分析仪分析结果。

2.4 数据分析:设定K562细胞的WT1 mRNA表达量为1.0，用β-actin校正后，计算出患者WT1 mRNA与K562细胞之间的相对表达量(患者WT1 mRNA的RT-PCR电泳扫描值/K562细胞WT1 mRNA的RT-PCR电泳扫描值)。组间差异性检验采用χ2检验，P＜0.05为有显著差异。

3 结果

正常人骨髓单个核细胞未检测出WT1 mRNA表达。40例患者中，33例可检测出不同程度的WT1 mRNA表达，阳性率为82.5%。其中2例M0，1例M1，1例M3，1例M4及2例M6均阴性。

所有患者除M3采用砷剂治疗外，其余采用标准DA：柔红霉素+阿糖胞苷方案化疗，27例完全缓解(CR)，其中，23例CR后WT1 mRNA在检出值以下，占69.7%；10例部分缓解(PR)，其中，7例PR后WT1 mRNA在化疗前检出值以下，占21.2%；3例无效(NR)，WT1 mRNA与化疗前比较变化不大。完全缓解患者中4例仍可检测出WT1 mRNA的较高表达，均在6个月内复发。CR后复发的4例患者，WT1 mRNA均再次升高。CR患者与未缓解患者之间，化疗前WT1 mRNA水平无显著差异(P＞0.05)，化疗后WT1 mRNA水平有显著差异(P＜0.05)。长期持续缓解者，WT1 mRNA值阴性或稳定在较低水平，复发患者1~2月前WT1 mRNA再次升高。

4 讨论

WT1基因编码DNA结合蛋白，其分子量大约在5.2万～5.4万之间。它的羧基端有4个锌指结构，分别由2个半胱氨酸和2个组氨酸组成，由第7～10个外显子编码；它的氨基端有一个区域富含谷氨酸/脯氨酸。其中锌指结构含有结合DNA的功能；富含谷/脯氨酸区则发挥转录调控功能［1］。WT1基因通过与特定基因转录起始位点的5’端和3’端都结合时，表现为抑制该基因转录；它一旦只与特定基因5’端或3’端结合时，则表现为激活该基因转录。因此它是具有抑制和激活双重功能的调节因子。近年来，发现WT1基因除具有在特定组织上如胎儿肾脏、卵巢及等组织表达的特性外，在髓系早期造血细胞也可见到高表达，而在正常成熟造血细胞表面未见表达或表达量极低[2,3]。

在急性髓系白血病治疗中，难以确切检测患者经化疗达到临床完全缓解后，患者骨髓中白血病细胞被杀灭的情况和骨髓中残留白血病细胞的量（微小残留病），无法及早评价白血病治疗效果，难以辨别和预防白血病复发。过去主要通过普通骨髓形态学及免疫组化方法检测骨髓残留白血病，阳性率仅能达到1%～5%，而现在随着分子生物学技术的进展，通过细胞分子水平PCR检测方法检出率则可以达到10-4～10-5。

本实验结果显示化疗前白血病细胞WT1量高（33/40）占82.5%。化疗后WT1量下降至检测不出来占69.7%（23/33），患者临床达到完全缓解；化疗后WT1量较化疗前部分下降占21.2%（7/33），患者临床呈部分缓解或完全缓解，呈临床缓解者多在6个月内复发；化疗后WT1量较化疗前变化不大占9%（3/33），患者临床呈治疗无效。化疗后WT1值长期检测不出，患者临床呈长期完全缓解，WT1值再次升高，患者多在1~2个月内复发。WT1值长期处于高水平，临床治疗常发生耐药，治疗效果差，往往需早期行骨髓移植治疗。从本实验结果可以看出WT1量与急性髓系白血病化疗后缓解与否，缓解持续时间及早期复发具有明显相关性。WT1长期稳定在低水平表明患者治疗效果好，处于缓解状态[4]。WT1值明显上升或持续上升，多提示白血病复发，需早期调整治疗方案或行骨髓移植。PCR动态测定WT1值可以作为监测急性髓系白血病微小残留量的重要指标，它可以评价化疗或骨髓移植的疗效［5］和确定白血病细胞的残留量，对早期预测复发，判定预后及选择治疗方案有重要的临床意义［6～10］。

参考文献

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[3] Menssen HD,Renkl HJ,etal.Presence of Wilms’ tumor gene (WT1) transcripts and the WT1 nuclear protein in the majority of human acute leukemias. Leukemia. 1995, 9(6):1060-1067

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