对氟喹诺酮类药物耐药的大肠埃希菌耐药机制研究
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1 药物作用靶位的改变
抗生素的杀菌、抑菌作用是与细菌不同部位上的靶位蛋白结合，抑制其功能而生效。而细菌的耐药则可以通过不同方式改变靶位蛋白结构，使抗菌药与其结合力下降或不能结合。DNA回旋酶和拓扑异构酶Ⅳ是喹诺酮类药物的主要作用靶位。
1.1 DNA回旋酶 DNA回旋酶是由2个A亚基和2个B亚基构成的四聚体，分别由gyrA 和gyrB基因编码。gyrA和gyrB基因的突变只限于编码一个氨基酸的3个碱基中的1个发生替换。gyrA的突变主要有4个位点，而且集中在较小的区域，将这一基因区段称为氟喹诺酮耐药决定区，已证实QRDR的突变与细菌耐药有直接关系。只有氨基酸发生取代的碱基突变才可改变细菌对药物的敏感性。gyrA的QRDR内氨基酸取代方式、位置、取代位点的多少与E.coli耐药水平有着密切的关系。尤其是gyrA基因改变最常见，其次是gyrB。gyrB基因突变较为单一，目前发现氨基酸的替换只有两个比较集中的位点，即第426和447位，都为单个氨基酸替换。gyrB突变促进gyrA突变耐药性的产生，目前尚无资料表明gyrB突变作为独立的耐喹诺酮类的机制。Ser83是gyrA 的基本突变点，gyrA基因中密码子83发生突变常常造成大肠埃希菌对喹诺酮类抗菌药物耐药。
1.2 拓扑异构酶Ⅳ 拓扑异构酶Ⅳ是由2个C基因和2个E基因组成的四聚体，分别由parC和parE基因编码。拓扑异构酶ⅣA亚单位和DNA 回旋酶A亚单位在NH2-末端有很高的同源性，即gyrA和parC的N末端均有与喹诺酮耐药决定区域QRDR有关的区域，在此区发生氨基酸的替代影响了喹诺酮类药物与酶结合的紧密关系，从而使其耐药性增加。拓扑异构酶Ⅳ只是药物的从属靶位，DNA 回旋酶对氟喹诺酮类药物比拓扑异构酶Ⅳ更敏感。通过PCR扩增大肠埃希菌耐药株的gyrA QRDR区和parC基因，进行PCR-SSCP分析；同时，PCR扩增marOR基因，在耐药株中随机选取进行测序，检测marOR基因突变情况。发现gyrA和parC基因突变引起大肠埃希菌产生耐药，Chenia HY等报道ParC突变发生在Ser-80/Glu-84，gyrA基因突变是产生对氟喹诺酮类耐药的主要原因，parC基因突变可引起菌株对氟喹诺酮类药物的高水平耐药。
2 膜通透性屏障及相关基因突变
大肠埃希菌增加抗生素渗透障碍的主要方式是改变跨膜通道孔蛋白结构性质，使其与抗生素结合力下降，以及减少跨膜通道孔蛋白数量甚至使之消失，从而减少药物在细胞内的积聚。大肠埃希菌外膜上存在多种外膜蛋白（Omp），主要有OmpA、OmpF、OmpC和蛋白K。其中外膜蛋白F（outer member protein F，OmpF）和外膜蛋白C（outer member protein C，OmpC）为大肠杆菌的主要外膜蛋白。OmpF和OmpC在大肠杆菌中的表达以协调方式紧密相关，以保持外膜蛋白总量的恒定。当细菌染色体的基因突变引起膜通透性降低影响药物的转运时，细菌即可发生耐药。在耐氟喹诺酮大肠埃希菌的染色体上已发现norB、norC、nfxc、nfxB和cfxB等多个染色体突变基因，携带这些突变基因的耐药株几乎都具有相同的表型-Omp的异常，尤其是作为亲水性小分子药物通道的OmpF的减少或缺失，使细菌对氟喹诺酮类药物的摄入减少。OmpC通道缺失的菌株对氟喹诺酮类药物的敏感性似乎不变，提示OmpF减少或缺失是细菌膜通透性降低的主要因素。OmpF的表达是通过micF基因调控的，它编码一小段反义RNA，与OmpF的mRNA5-末端互补，从而阻止OmpF的翻译过程，最终导致OmpF的蛋白合成量降低。对大肠埃希菌norC突变株的研究表明，仅由膜通透性降低所引起的药物蓄积浓度减少极其有限，这提示除OmpF异常外，一定还存在其他引起药物蓄积浓度的降低的决定因素。同时还发现具有粗糙LPS的大肠埃希菌内环丙沙星蓄积量高于具有光滑LPS的菌株，并且与OmpF的表达无关。
3主动外排活跃
主动外排系统是指细菌细胞内膜存在能量依赖性蛋白外排泵，通过主动外排作用将药物从菌体排出，使达到作用靶位的药量明显减少，不足以发挥杀菌或抑菌作用。目前发现与氟喹诺酮类药物耐药性有关的主动外排系统均为多重药物外排泵。多重药物外排泵根据其转运蛋白的作用方式及消耗能量的来源不同分为两类：一类是以质子驱动力为能量，以"H-药物"方式向细胞外作反向转运；另一类为ABC，以ATP驱动力为能量，由ATP结合盒向胞外转运。大肠埃希菌以前者为主，前者按转运蛋白的分子结构、同源性及作用方式又可分为4类。大肠埃希菌与氟喹诺酮类药物耐药性有关的主动外排泵有3个：AcrAB、MdfA和NorE。其中AcrAB-TolC系统为主要代表，是目前耐药研究中的热点，属于质子依赖型，能够产生对多种抗菌药的高水平的多重耐药。AcrAB-TolC系统主要由细胞内膜泵（AcrB）通过跨膜融合蛋白（AcrA）与外膜的排除泵（TolC）连接而组成。通常情况下AcrAB-TolC系统处于低水平表达，但在选择性压力下会去阻遏出现高表达。发现，药物分子外排主要和H 相偶联，它们构成一个反向转运蛋白，通道开放后，H由于浓度梯度内流，药物分子随即外排。AcrAB由acrAB操纵子编码，而编码外膜蛋白TolC 的基因tolC则位于染色体的其它区域。acrAB的表达受多种调控因子的调节，MarA、RobA、SoxS是aerAB的正调控蛋白，可同时增加AcrAB和tolC的表达。Jellen-Ritter等研究表明acrR是位于acrAB基因上游的阻遏蛋白基因，可通过直接增加AcrR数量阻止acrAB超表达，acrR突变去阻遏，也可使acrAB表达增加。同时发现acrAB缺失突变体也表现出对氟喹诺酮类药物耐药性和多重药物耐药表型。另外MppA对acrB的转录起负调节作用，mppA的无意义突变株中外膜蛋白OmpF的表达也减少了，可与外排泵产生协同耐药。主动外排泵激活剂（葡萄糖）和抑制剂（氰氯苯腙）对氟喹诺酮类药物在菌体内蓄积量的影响，证明主动外排泵对相对亲水性氟喹诺酮类药物的泵出功能明显强于其对疏水性氟喹诺酮类药物的作用。
综上所述，大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物耐药机制：药物作用靶位的改变、膜通透性降低及主动外排活跃、质粒介导的耐药机制，可单独或协同作用，使细菌发生对氟喹诺酮类药物耐药，甚至多重耐药。因此我们应该合理使用抗感染药物，研究细菌耐药机制以及抗生素疗效评价，寻找和研制有抗菌活性的新抗菌药物，同时寻找有效的酶抑制剂。
参考文献：
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[2]方治平，徐炜，刘小康，等.大肠杆菌体内氟喹诺酮类药物耐药机制的研究[J].四川大学学报，医学版，2008，36（1）：86～89.